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单核细胞增生性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）简称单增李斯特,它是一种能够引起人畜共患的食源性致病菌,属李斯特菌属。它在自然界中分布广泛,如土壤、腐败的蔬菜及多种食品中。食用了被单增李斯特污染的食物后可以引起“李氏杆菌病”,使人和动物患脑膜炎、败血症、流产等,死亡率可达20%～30%。该菌主要侵袭孕妇、新生儿、老年人和免疫力低的人群。近年来由该菌引起的食物中毒事件越来越多,引起了人们的广泛关注。传统的检测单增李斯特的方法操作繁琐、检测时间较长,通常需要5～7d才能完成且灵敏度较低。不能满足食品中致病菌快速、灵敏的检测需要。因此需要建立快速、灵敏的单增李斯特的检验方法。目前,快速检测单增李斯特的方法报道最多的是应用PCR方法。环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP）是2000年由日本的荣研株式会独自开发出来的一种新的核酸扩增方法。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物,利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNApolymerase）在恒温条件（65℃左右）下进行扩增。可以在1h之内,将靶DNA片段扩增109～1010倍。本研究以单增李斯特的李氏溶血素基因（hly）为靶基因,选择特异性引物进行PCR扩增,同时成功设计了LAMP引物进行LAMP反应,并与PCR进行比较。对PCR反应体系中镁离子浓度、退火温度和循环数等PCR影响要素进行优化,以确定适宜PCR反应体系和PCR扩增程序。PCR反应的总反应体系为50μL,其中含有5μL 10×PCR buffer,4μL dNTPs混合物,2μL 10μmol/L上游引物,2μL 10μmol/L下游引物,4μL氯化镁,0.5μL（5U/μL）Taq DNA聚合酶,32.5μL ddH2O;PCR扩增程序为:PCR反应采用冷启动,94℃预变性4min,再按94℃变性45s～60℃退火30s～72℃延伸45s进行35个循环,最后72℃再延伸5min。PCR反应产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统观察结果,产生预期大小的片段（702bp）。基于单增李斯特的hly基因利用官方设计软件设计出LAMP反应的外引物F3、B3和内引物FIP、BIP。并对反应时间、反应温度、镁离子浓度、内外引物浓度比等扩增条件进行优化。LAMP反应的总反应体系为25μL,其中含有0.8μmol/L的FIP和BIP,0.2μmol/L的F3和B3,400μmol/L的每种dNTP,1mol/L的甜菜碱,20mM Tris-HCl（pH8.8）,10mM KCI,10mM（NH4）2SO4,4mM MgSO4,0.1%Triton-100和一定量的模版DNA。将反应混合物在95℃加热5min后放置冰上冷却,然后加入8U的Bst DNA聚合酶大片段,在63℃孵育60min,然后在80℃加热10min终止反应。LAMP反应产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统观察结果,产生预期的梯形条带。对12株菌分别进行了PCR反应和LAMP反应来验证引物的特异性,结果表明:单增李斯特均为阳性结果,其它菌株均为阴性结果。采用FTA滤膜制备模板进行PCR和LAMP反应,其方法的灵敏度分别为1.4×102CFU/mL和7.3×10CFU/mL。利用PCR技术和LAMP技术直接检测人工污染的鸡肉中的单增李斯特,检出限分别为9.6×102CFU/g和8.9×10CFU/g。通过两种方法的比较,可知LAMP比PCR更快速、灵敏。有着更为广泛的发展前景。通过本课题的研究,为单增李斯特氏菌的快速检验构建了一个新的技术平台。