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核因子kB(NF-kB)信号通路活性受到细胞质多种蛋白的精细调控,NF-kB与这些蛋白质组成了NF-kB系统,多种因素可引起NF-kB信号转导途径的激活。NF-kB调控大量基因的转录,特别是一些涉及免疫应答和炎症应答的基因,NF-kB信号通路参与了炎症、细胞增殖、细胞凋亡等方面的调控,目前所知的NF-kB所诱导表达的基因大多与细胞的生长和存活有关。蛋白磷酸酯酶2C(PP2C)家族成员大多与细胞生长和细胞应激应答的信号通路相关,其中金属依赖性蛋白磷酸酯酶1A(PPM1A)、PPM1B、PPM1L、PPM1F、PPM1E、整联蛋白偶联激酶相关的磷酸酯酶(ILKAP)等PP2C家族蛋白成员直接参与了NF-kB信号通路主要路径或旁路的调控,但是PP2C蛋白家族蛋白成员PPM1M的底物与生理功能却尚未证实,基于PPM1M的结构和序列与上述PP2C家族蛋白的相似性,检测了PPM1M在NF-kB信号通路中的功能。
采用RNA干扰(RNAi)技术抑制PPM1M的mRNA表达,从而研究其在NF-kB信号通路中的作用。本实验从3条不同的靶向PPM1M的小干扰RNA(siRNA)中筛选出最有效的1条siRNA,即PPM1MsiRNA1,并且用PPM1MsiRNA_1干扰PPM1M后发现抑制PPM1M的表达会降低NF-kB信号通路的活性。表达并纯化了PPM1M-GST融合蛋白以用于PPM1M与NF-k信号通路中蛋白相互作用的研究。另外,本实验还检测了肿瘤坏死因子α(TNFα)在Hela细胞中时间梯度的刺激效应,结果发现,从0分钟到30分钟核因子kB抑制子α(IkBα)的表达量逐渐下降,而60分钟时IkBα的表达量开始上升,因此选择30分钟作为PPM1M定位实验的TNFα刺激时间。在免疫荧光蛋白定位实验中发现:在Hela细胞中,非刺激状态和刺激状态下PPM1M均定位于细胞质中,因此在相互作用实验中选择NF-kB信号通路细胞质部位的蛋白作为靶点,并且发现肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)、核因子kB抑制子激酶β(IKKβ)和p52与PPM1M均有相互作用。本实验的研究为PPM1M功能的进一步研究提供了新思路。