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ALI/ARDS(急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征)是临床常见的危急重症,是由各种因素导致弥漫性肺泡-毛细血管膜损伤,进而引起以非心源性肺水肿和炎症为病理特征的急性呼吸衰竭。虽然经过几十年的临床和基础研究,但目前尚无十分有效的针对ALI/ARDS的治疗措施,其病死率依然高达40%以上[1]。因此,深入研究ALI/ARDS的发病机制,寻找新的有效的治疗方法和新药开发是目前ALI/ARDS的主要研究方向。过氧化物酶增殖体激活受体γ(Perroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ)是核受体超家族一员[2]。研究表明,PPARγ的表达或活性增强后可产生强力有效的抗炎作用抑制ALI/ARDS过激的炎症反应,从而减轻病理损伤对机体产生保护作用,因此有学者认为PPARγ有可能成为ALI/ARDS的一新的治疗靶点[3~6]。但在ALI/ARDS的发病过程中通常伴随着PPARγ的表达及活性下降,其具体调控机制不明[6,7]。受体相互作用蛋白(Receptor interacting protein 140,RIP140)是PPARγ的一转录辅助抑制因子,对PPARγ的活性起负调控作用[8,10]。但目前仍不清楚在ALI/ARDS的发病过程中RIP140与PPARγ的相互关系以及其是否对PPARγ的表达和活性具有调节作用。因此,本研究中我们首先研究了RIP140在ALI/ARDS时肺组织中及巨噬细胞的表达变化,在此基础上通过基因技术下调RIP140表达观察对PPARγ表达和活性的影响。从辅助因子层面探讨了PPARγ的上游调控机制,为PPARγ今后在ALI/ARDS的进一步运用提供理论基础。目的:探讨脓毒症肺损伤时RIP140对PPARγ的调控作用,阐明在ALI/ARDS时PPARγ的上游调控机制。方法:1.脓毒症急性肺损伤RIP140在肺组织中的表达研究通过盲肠结扎穿孔术复制大鼠脓毒症肺损伤模型;随后,使用免疫组化技术、Western-blot、激光共聚焦技术观察在脓毒症肺损伤时RIP140在肺组织中的表达及定位。2.RIP140对巨噬细胞炎症应答时PPARγ表达及活性的调控研究Western-blot技术观察在LPS刺激后RAW264.7巨噬细胞内RIP140和PPARγ的表达变化。在此基础上,构建rip140shrna腺病毒载体,转染体外培养的raw264.7巨噬细胞,使用rt-pcr、westernblot、elisa观察在巨噬细胞炎症反应过程中下调rip140的表达对pparγ表达活性及对下游炎性因子的表达影响。3.下调rip140的表达对小鼠脓毒症急性肺损伤肺组织炎症反应的影响首先,通过腹腔注射lps复制小鼠脓毒症肺损伤,westernblot检测rip140和pparγ的表达变化规律。随后,通过体内转染技术下调rip140的表达,westernblot检测脓毒症肺损伤时下调rip140对pparγ表达的影响,rt-qpcr、he染色观察下调rip140是否通过pparγ影响肺组织炎性因子表达及病理损伤。结果:1.成功的复制了脓毒症肺损伤动物模型,在正常大鼠及假手术组大鼠的肺泡巨噬细胞中rip140呈一较低表达水平。而clp后6h,rip140的表达水平较对照组开始升高(p﹤0.05)至12~24h维持一较高水平(p﹤0.05)。通过激光共聚焦免疫荧光进一步发现rip140主要表达于胞核。2.lps刺激6h后巨噬细胞中rip140的表达较0h组开始上升(p<0.01),至12~24h维持在一较高的表达水平。在rip140表达升高的同时pparγ的表达开始下降(p<0.01)至12h其表达水平降至最低(p<0.05)。通过基因技术下调rip140的表达后pparγ的表达及活性即恢复,这一效应可被pparγ阻断剂gw9662所抑制。下调rip140的表达可明显抑制il-1β、tnf-α、il-6mrna的表达及释放,而这一抗炎效应可被gw9662抑制。3.在lps刺激后6h小鼠肺组织中rip140的表达较0h,3h组开始升高(p<0.05),并持续至24h。与此相反的是,在lps刺激后6h肺组织中pparγ的表达水平较0h,3h组开始下降(p<0.05)至12~24h为此一较低的水平。通过rip140shrna腺病毒载体下调小鼠肺组织rip140表达发现:rip140shrna+lps组小鼠肺组织中il-1β、tnf-α、il-6mrna表达水平明显低于空载体+lps组(p<0.05),但在使用pparγ阻断剂gw9662后这些促炎基因的表达水平的明显高rip140shrna+lps组(p<0.05)。通过he染色我们进一步证实:rip140shrna+lps组小鼠肺组织病理损伤明显低于空载体+lps组,但这一保护作用可明显被pparγ阻断剂gw9662逆转结论:1.脓毒症肺损伤时rip140在肺组织中主要表达于炎性细胞,通过体外分离培养脓毒症肺损伤大鼠现肺泡巨噬细胞进一步发现rip140在肺泡巨噬细胞的表达水平明显升高且其主要表达于胞核;2.成功的构建了对细胞毒性作用小转染效率高的腺病毒载体,通过该载体携带的RIP140shRNA可有效下调肺泡巨噬细胞RIP140表达;下调巨噬细胞RIP140的表达可恢复炎症应答过程中PPARγ的表达及活性,从细胞水平证实了RIP140对PPARγ的表达及活性存在调控作用;同时还发现,下调巨噬细胞RIP140的表达可通过增强PPARγ的表达及活性,抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达及释放。3.通过体内转染证实:在ALI/ARDS时下调肺组织中RIP140的表达可明显升高PPARγ的表达水平,进而抑制肺组织中促炎基因的表达减轻肺组织病理损伤。从体内水平证实了RIP140对PPARγ的表达及活性存在调控作用。