PTPLAD2在食管鳞状细胞癌中的表达及其相关功能的初步研究

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研究背景:酪氨酸蛋白磷酸酶样A结构域2(protein tyrosine phosphatase-like Adomain containing2, PTPLAD2),也被称为3-羟酰基辅酶A脱氢酶4(3-hydroxyacyl-CoA dehydratase4,HACD4),是含有232个氨基酸的6次跨膜蛋白,属HACD极长链脂肪酸脱水蛋白家族成员,PTPLAD2与酪氨酸蛋白磷酸酶(protein tyrosine phosphatases,PTP)家族成员有相似结构,PTP家族成员受体蛋白结构高度保守,其中多个分子已证实与肿瘤的发生有关,但迄今为止PTP家族蛋白在肿瘤形成中的作用机理尚未明确。信号转导与转录激活因子(signal transducer andactivator of transcription,STAT)是一种可以被细胞膜信号直接诱导进入细胞核活化基因转录的蛋白,当STAT被磷酸化后(p-STAT),发生聚合成为同源或异源二聚体形式的活化的转录激活因子,进入胞核内与靶基因启动子序列的特定位点结合,促进其转录。在STAT家族蛋白中,信号转导与转录激活因子3(signal transducer andactivator of transcription3,STAT3)被认为是大量癌基因信号转导通路的汇聚点,并且该蛋白控制着多种促炎因子和生长因子的信号转导通路,STAT3可参与多种肿瘤发生发展,已有文献在体内、体外实验中证实其可以促进食管鳞状细胞癌(esophagealsquamous cell carcinoma,ESCC)的增殖和侵袭。基于前期激光显微捕获切割和Affymetrix SNP6.0芯片结果,我们发现PTPLAD2基因在食管鳞状细胞癌中存在高频率杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH),提示PTPLAD2可能是食管鳞状细胞癌发生相关的新的潜在抑癌基因。在本研究中,我们通过免疫组化方法检测食管鳞状细胞癌组织中PTPLAD2蛋白及p-STAT3蛋白的表达和定位情况,进一步分析PTPLAD2和p-STAT3的表达与食管鳞状细胞癌患者预后以及食管鳞状细胞癌临床病理特点之间的关系;并在体内和体外实验中研究PTPLAD2及STAT3在HET-1A细胞、Eca-109细胞增殖中的作用及它们之间可能存在的相互作用机制,对PTPLAD2在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用及其机制进行了初步探讨。方法:首先,研究食管鳞状细胞癌组织及正常食管上皮组织中PTPLAD2和p-STAT3的表达:(1)采用qRT-PCR和免疫印迹等方法检测PTPLAD2在食管鳞状细胞癌组织以及正常食管鳞状上皮中的表达;(2)采用免疫组化方法检测PTPLAD2和p-STAT3在食管鳞状细胞癌组织及正常食管鳞状上皮中的表达和定位;(3)根据随访资料分析PTPLAD2及p-STAT3的表达与食管鳞状细胞癌患者预后的关系;(4)应用统计学软件分析PTPLAD2及p-STAT3的表达和食管鳞状细胞癌组织分化程度、浸润深度以及是否有淋巴结转移之间的相关性。随后,通过体内和体外实验对PTPLAD2和STAT3在细胞增殖中的作用进行了研究:(1)将shRNA againstPTPLAD2质粒转染进入HET-1A(NIH/3T3)细胞,抑制HET-1A(NIH/3T3)细胞内PTPLAD2基因的表达,观察HET-1A(NIH/3T3)细胞增殖变化情况;(2)将过表达PTPLAD2质粒(pcDNA-PTPLAD2)转染进入Eca-109细胞后,观察Eca-109细胞增殖变化情况;(3)将STAT3-CA(可使STAT3过度激活)质粒转染进入HET-1A细胞,激活STAT3的活性,观察HET-1A细胞增殖变化情况;(4)将shRNA againstSTAT3转染进入Eca-109细胞,使得STAT3基因沉默,抑制Eca-109细胞内STAT3基因的表达,观察Eca-109细胞增殖变化情况;(5)在小鼠皮下接种转染pcDNA-PTPLAD2质粒的Eca-109细胞,观察裸鼠成瘤情况;(6)在小鼠皮下接种STAT3基因沉默的Eca-109细胞,观察裸鼠成瘤变化情况。最后用免疫印迹方法检测在细胞内当PTPLAD2表达水平改变后,STAT3水平、STAT3磷酸化水平以及STAT3上下游作用分子的蛋白水平变化情况,对PTPLAD2和STAT3对细胞增殖影响可能相互作用机制进行了初步研究。结果:1、相对于正常食管鳞状上皮,食管鳞状细胞癌组织中PTPLAD2的表达降低,而p-STAT3的表达升高:(1)食管鳞状细胞癌组织中检测出PTPLAD2的mRNA水平及蛋白的表达水平均降低。同时食管癌细胞系Eca-109细胞中PTPLAD2蛋白的表达水平也低于其在正常食管细胞系HET-1A细胞中的表达水平;(2)通过免疫组化检测发现食管鳞状细胞癌组织中PTPLAD2的表达主要分布在肿瘤细胞膜,而p-STAT3的表达主要分布在细胞核;(3)随访结果显示食管鳞状细胞癌组织中PTPLAD2的表达水平与患者的预后呈正相关,PTPLAD2表达水平越高的患者预后越好,而p-STAT3的表达水平则与患者的预后呈负相关,p-STAT3表达水平越高的患者预后越差;(4)对食管鳞状细胞癌组织及正常食管上皮组织免疫组织化学检测结果进行统计学分析,结果显示相对在正常组织中的表达,PTPLAD2在食管鳞状细胞癌组织中表达阳性率较低,肿瘤分化越差、浸润越深以及伴有淋巴结癌转移的病例表达越低,而p-STAT3在食管鳞状细胞癌组织中表达阳性率较高,肿瘤分化越差、浸润越深的病例表达越高。2、通过体内及体外实验对PTPLAD2和STAT3在HET-1A细胞和Eca-109细胞中的功能进行了初步的研究:(1)抑制HET-1A和NIH/3T3细胞内PTPLAD2基因的表达,MTT和集落形成实验显示HET-1A和NIH/3T3细胞的增殖能力增加;(2)将pcDNA-PTPLAD2质粒转染进入Eca-109细胞后,MTT和集落形成实验证实Eca-109细胞的增殖能力明显降低;(3)将HET-1A细胞内STAT3活性激活后,MTT和集落形成实验证实HET-1A细胞的增殖能力增加;(4)抑制Eca-109细胞内STAT3基因的表达,MTT和集落形成实验证实Eca-109细胞的增殖能力减低;(5)在小鼠皮下接种转染pcDNA-PTPLAD2质粒的Eca-109细胞,裸鼠皮下成瘤受到抑制;(6)在小鼠皮下接种STAT3基因沉默的Eca-109细胞,裸鼠皮下成瘤受到抑制。3、食管鳞状细胞癌中PTPLAD2和STAT3相互作用机制的研究:(1)PTPLAD2表达水平的改变可以影响STAT3的磷酸化水平,但对调控STAT3基因的上游分子没有明显影响;(2)PTPLAD2表达水平的改变可以影响STAT3下游基因FOXM1的表达水平。结论:(1)相对于正常食管鳞状上皮,PTPLAD2在食管鳞状细胞癌中的表达降低,PTPLAD2可能是食管鳞状细胞癌发生相关的新的潜在抑癌基因;(2)PTPLAD2的表达水平与食管鳞状细胞癌患者的预后呈正相关;癌组织中PTPLAD2蛋白表达水平高的食管鳞状细胞癌患者预后好,而p-STAT3蛋白则相反,癌组织p-STAT3蛋白表达水平高的患者预后差;(3)PTPLAD2可以抑制细胞的增殖,这种抑制作用可能是通过降低STAT3的磷酸化水平,从而降低其活性实现的。综上所述,本研究初步显示,PTPLAD2可能是食管鳞状细胞癌发生相关的新的潜在的抑癌基因,其作用机制可能与降低STAT3磷酸化水平有关。为进一步明确食管鳞状细胞癌的发生机制,以及食管鳞状细胞癌的个体化诊疗提供了新的思路及初步理论基础。
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