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背景:糖尿病是全球最常见的代谢性疾病。糖尿病大血管和微血管病变可引起血管稳态失衡、血管细胞功能障碍,是糖尿病致死致残的主要原因。细胞衰老是指细胞脱离细胞周期并丧失增殖能力后进入一种相对稳定的状态。内皮细胞衰老与心血管疾病关系密切,参与了动脉粥样硬化、血管重塑和炎症、血栓栓塞等的形成和发展。研究显示,众多因素能加速内皮细胞衰老,如高血糖、糖基化终末产物、过氧化氢、氧化低密度脂蛋白、辐射等。血管内皮细胞衰老是糖尿病血管病变的重要原因。Pdao相关激酶(ROCK)是体内一种丝氨酸/苏氨酸激酶,具有ROCK1和ROCK2两种亚型。既往研究显示ROCK主要功能是介导RhoA诱导细胞生成弹力纤维和局部粘附。近来研究发现ROCK参与调节内皮细胞功能障碍、血管弹性、炎症、氧化应激以及炎症等血管病理过程,在动脉粥样硬化、肺动脉高压、心力衰竭等许多心血管疾病中亦具有重要作用。以往研究表明高糖培养内皮细胞可显著提高ROCK活性,与其诱导内皮细胞功能障碍密切相关。体外研究发现抑制ROCK能提高内皮型一氧化氮合成酶(eNOS) mRNA稳定性并增强其活性,从而促进内皮细胞合成和释放一氧化氮(NO)。内皮细胞NO水平与其衰老有密切关系,增加内皮细胞NO水平具有抗衰老作用,而使用eNOS抑制剂非对称二甲基L-精氨酸和L-NAME促进内皮细胞衰老。动物实验和临床基础研究表明,抑制ROCK活性可以减轻糖尿病诱导的微血管损伤。这些研究提示抑制ROCK可能具有抗高糖诱导内皮细胞衰老的作用。目的：1探讨ROCK抑制剂Y27632对高糖诱导内皮细胞衰老的影响。2探讨敲减ROCK1和ROCK2对高糖诱导内皮细胞衰老的影响,并比较ROCK1和ROCK2的作用差异。3探讨ROCK在高糖诱导内皮细胞衰老中的作用机制。方法：1先后使用结合抗CD31抗体和抗CD102抗体的免疫磁珠分离纯化获得小鼠心脏内皮细胞,通过镜下观察和抗vWF抗体染色鉴定内皮细胞。2使用22mmol/L葡萄糖干预内皮细胞72小时诱导细胞衰老。使用10umol/L ROCK抑制剂Y27632作用观察对高糖诱导内皮细胞衰老的影响。通过衰老相关的p半乳糖苷酶(SA-PG)染色观察衰老细胞比例,流式细胞术分析细胞周期,采用Telo TAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS试剂盒检测内皮细胞端粒酶活性,Western blot分析ROCK1、ROCK2、p-MBS (Thr853)、MBS、p21等蛋白表达,采用一氧化氮试剂盒检测细胞培养基上清液NO水平。3使用ROCK1敲减和ROCK2敲减小鼠心脏内皮细胞,观察降低ROCK表达对高糖诱导内皮细胞衰老的影响。同时使用20umol/LPI3K抑制剂LY294002探讨可能的作用机制。通过SA-βG染色观察衰老细胞比例,Real-Time PCR分析eNOS mRNA表达变化,检测内皮细胞端粒酶活性,Western blot分析ROCK1、ROCK2、p-MBS (Thr853)、MBS、p-Akt、Akt、p-eNOS(Ser1177)、 eNOS等蛋白质表达,并检测细胞培养基上清液NO水平。结果：1采用免疫磁珠法所纯化获得的小鼠心脏内皮细胞生长良好,形态正常,内皮细胞vWF染色阳性率大于95%,并可在体外稳定传代培养,且冻存后复苏仍保持良好活性。2高糖显著提高小鼠心脏内皮细胞SA-βG染色阳性率,增强ROCK活性,提高G0/G1期细胞比例及其p21表达水平,抑制内皮细胞端粒酶活性,并降低细胞培养基中NO水平(p均<0.05)。ROCK抑制剂Y27632能显著抑制ROCK活性,有效抑制高糖诱导内皮细胞衰老,降低高糖环境下G0/G1期细胞比例及p21表达水平,同时逆转高糖环境下内皮细胞端粒酶活性和细胞培养基中NO含量下降(p均<0.05)。3分离获得ROCK1敲减和ROCK2敲减小鼠心脏内皮细胞,并进行高糖诱导内皮细胞衰老。与野生型内皮细胞相比,ROCK1敲减和ROCK2敲减能显著抑制ROCK活性,降低高糖培养内皮细胞SA-βG染色阳性率,提高高糖培养内皮细胞eNOS mRNA表达水平,增强其eNOS活性和表达,提高端粒酶活性以及培养基NO水平(p均<0.05)。ROCKl敲减和ROCK2敲减的上述作用无显著差异(p均>0.05)。但是,LY294002显著消除ROCK1敲减和ROCK2敲减的上述作用(p均<0.05)。结论：1使用免疫磁珠法可以分离纯化获得大量高纯度小鼠心脏内皮细胞。2高糖诱导小鼠心脏内皮细胞衰老与激活ROCK相关。3ROCK抑制剂Y27632以及敲减ROCK1和ROCK2均能有效抑制高糖诱导内皮细胞衰老。ROCK1敲减和ROCK2敲减抑制高糖诱导内皮细胞衰老的作用类似。4抑制ROCK对高糖诱导内皮细胞衰老的作用与介导PI3K/Akt/eNOS通路有关。