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临床上的多种外科急症，例如胰腺炎、梗阻性化脓性胆管炎、肠梗阻等常并存内毒素血症。内毒素血症并发的多器官损伤中，肺脏是最易受损伤的靶器官，内毒素血症急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)作为临床急危重病手术中出现最早，发生率最高的术前并发症，治疗手段主要局限于机械通气呼吸支持，未改变其病理生理过程，死亡率居高不下。因此，迫切需要探索有效减轻和治疗内毒素血症ALI的新方法及其分子机制。 低氧诱导因子-1α(HIF-1α)起初被认为是缺氧状态下诱导表达的转录因子，通过调控下游包括血红素加氧酶-1（HO-1）等靶基因的表达减少氧张力，发挥细胞保护作用。随着低氧与炎症之间联系研究的不断深入，发现HIF-1α在常氧状态下也可被诱导表达，参与调控免疫反应，其稳定表达可通过上调下游靶基因发挥抗炎作用。 研究发现吸入麻醉药异氟烷对内毒素血症 ALI具有保护作用。体外实验显示，异氟烷可下调内毒素对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的诱导表达，其抗炎作用部分通过HIF-1α下游靶基因HO-1信号途径实现。盲肠结扎穿刺ALI体内模型中，异氟烷通过上调HO-1表达改善肺血管通透性，减轻肺损伤。由此我们推测：吸入麻醉药异氟烷对内毒素血症 ALI的保护作用很可能通过 HIF-1α/HO-1表达上调来实现。 微小RNA(MicroRNA，miR)是一类高度保守的非编码寡核苷酸链，在转录后水平通过与靶mRNA3’端非翻译区(Untranslated Regions,UTRs)结合使其降解或抑制其翻译调控靶基因表达。miR-155在天然免疫中发挥重要调控作用，LPS诱导下表达明显升高，与ALI发生密切相关。有研究报道长时缺氧下HIF-1α是miR-155的靶基因，且前期实验中发现异氟烷处理内毒素血症小鼠肺miR-155表达明显降低，HIF-1α表达明显升高。由此推测：异氟烷对内毒素血症ALI具有一定程度的保护作用，其效应可能通过调控miR-155/HIF-1α/HO-1途径实现。 本次研究中，我们将分别在离体和在体两方面研究吸入麻醉药异氟烷是否能减轻内毒素血症ALI，并通过慢病毒转染上调及下调miR-155表达，siRNA干扰HIF-1α等技术明确miR-155、HIF-1α及HO-1在其中的作用和地位。本实验分为以下四个部分： 第一部分：miR-155与靶基因HIF-1α的结构验证 目的：结构验证确认HIF-1α为miR-155靶基因，为后续研究miR-155及HIF-1α在异氟烷减轻内毒素血症ALI中地位奠定基础。 方法：构建HIF-1α3’UTR及HIF-1α3’UTR突变质粒，通过双荧光素报告分析验证miR-155与HIF-1α的关系。 结果：成功构建了Psi-CHECKTM-2-HIF-1α-3’UTR及Psi-CHECKTM-2-HIF-1α-3’UTR mutant质粒，通过双荧光素报告分析证实HIF-1α为miR-155靶基因。 结论：在常氧状态下，miR-155可与HIF-1α-3’UTR结合并抑制其蛋白表达，HIF-1α为miR-155靶基因。 第二部分：miR-155过表达慢病毒及miR-155-5P下调表达慢病毒构建 目的：构建miR-155过表达及miR-155下调表达慢病毒，为研究miR-155在异氟烷对内毒素血症ALI保护作用中的地位奠定基础。 方法：设计pre-miR-155引物及miR-155-5p-inhibition引物，构建能有效上调及下调miR-155的慢病毒，感染小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S）及小鼠肺上皮细胞（MLE-12）及小鼠肺脏并予qRT-PCR鉴定。 结果：成功构建了滴度为8×108TU/ml的miR-155过表达慢病毒，经qRT-PCR进行鉴定证实MH-S及MLE-12中miR-155表达上调7.67倍及6.99倍。体内肺组织miR-155表达上调3.59倍。成功构建了滴度为1×109TU/ml的miR-155下调表达慢病毒，经qRT-PCR进行鉴定证实MH-S及MLE-12中对miR-155抑制效率为47.67％及33.22%。体内肺组织miR-155下调22.7%。 结论：构建miR-155过表达及miR-155下调表达慢病毒能稳定改变MH-S、MLE-12及小鼠肺组织中miR-155水平。 第三部分：异氟烷抑制小鼠肺泡巨噬细胞MH-S及小鼠肺上皮II型细胞MLE-12 miR-155表达及机制研究 目的：以MH-S及MLE-12为研究对象，探讨异氟烷是否能通过抑制miR-155上调HIF-1α及其下游靶基因HO-1表达。 方法：CCK-8检测临床常用浓度及处理时长的异氟烷对TNF-α及脂多糖（LPS）共刺激细胞的增殖影响;qRT-PCR检测异氟烷干预TNF-α及LPS处理细胞miR-155和HIF-1α表达情况；western blot检测异氟烷对LPS处理细胞HIF-1α及HO-1表达的影响。以过表达及下调表达miR-155慢病毒转染细胞为研究对象明确miR-155在异氟烷保护作用中的地位；通过转染HIF-1αsiRNA明确HIF-1α在异氟烷保护作用中的地位。 结果：0.32mM异氟烷处理4h可减轻TNF-α及LPS刺激对MH-S和MLE-12的损伤。异氟烷可通过抑制miR-155诱导HIF-1α及其下游靶基因HO-1蛋白的表达。过表达miR-155部分阻断异氟烷对HIF-1α的影响，下调miR-155表达可促进异氟烷诱导HIF-1α及HO-1表达。 结论：异氟烷对TNF-α及LPS刺激下MH-S及MLE-12细胞具有保护作用，此作用可能与其抑制miR-155表达，诱导HIF-1α及下游HO-1表达上调有关。 第四部分：异氟烷减轻内毒素血症小鼠肺损伤炎症反应的在体研究目的：通过在体实验明确异氟烷是否能减轻内毒素血症急性肺损伤小鼠肺部炎症反应。运用miR-155过表达及miR-155下调慢病毒感染小鼠明确miR-155、HIF-1α及HO-1在其中的作用。 方法：取雄性C57BL6小鼠24只，随机分为 Control组，Isoflurane组，LPS组及LPS-Isoflurane组（n=6）。Control组和Isoflurane组腹腔注射生理盐水；LPS组及LPS-Isoflurane组腹腔注射30mg/kgLPS(1mg/ml)。24h后Control组和LPS组吸入空气4h，Isoflurane组和LPS-Isoflurane组吸入1.5%异氟烷处理4h。另取雄性C57BL6小鼠96只，分别尾静脉注射miR-155过表达，miR-155 inhbition，miR-155 EV和miR-155 inhibition EV慢病毒颗粒（n=24）。14天后各组慢病毒感染细胞随机分为Control组，Isoflurane组，LPS组及LPS-Isoflurane组（n=6），LPS处理及异氟烷干预操作同前。取各组小鼠肺组织做组织学检测，肺泡灌洗液（BALF）TNF-α及IL-1β水平检测；qRT-PCR检测各组小鼠肺组织miR-155和HIF-1α表达情况；免疫组化或western blot检测HIF-1α及HO-1表达。 结果：异氟烷显著降低内毒素血症ALI小鼠肺损伤评分，降低BALF中TNF-α及IL-1β水平，下调miR-155并诱导HIF-1α和HO-1蛋白表达。过表达miR-155部分阻断异氟烷对内毒素血症ALI小鼠肺保护作用，抑制HIF-1α及HO-1表达。抑制内源性miR-155促进异氟烷减轻内毒素血症ALI炎症反应。 结论：异氟烷减轻内毒素血症ALI小鼠肺部炎症反应，此作用可能与其抑制miR-155表达，诱导HIF-1α及下游HO-1表达有关。