论文部分内容阅读
背景胰腺癌是恶性程度极高的恶性肿瘤之一,近年来虽然手术切除率和根治率有所提升,但5年生存率仍在8%左右。胰腺癌的免疫微环境以免疫抑制性T细胞聚集为特征,多种途径诱导的免疫逃逸是胰腺癌极早期即可发生淋巴结和远处转移的重要原因,因此预后极差。外泌体是直径50-150 nm的细胞外囊泡,作为一种细胞间通讯载体,通过抑制免疫应答及诱导免疫抑制性分子的方式参与免疫调节。然而,胰腺癌来源的外泌体通过何种途径诱导免疫抑制性T细胞来介导免疫逃逸,具体机制尚未完全阐明。目的本研究旨在探索胰腺癌来源的外泌体对T细胞基因表达、免疫表型及免疫功能的影响,为阐明胰腺癌的免疫逃逸机理及探索精准免疫治疗提供理论依据。方法采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离纯化外周血T淋巴细胞并进行体外培养;采用超速离心法提取胰腺癌细胞培养上清液中的外泌体,并使用电子显微镜、粒径分析及分子标记物Western Blot检测对提取的外泌体进行纯度鉴定;将提纯的胰腺癌细胞来源外泌体用于刺激体外培养的T淋巴细胞。使用CD63-td Tomato标记外泌体并用于刺激体外培养的T淋巴细胞,使用共聚焦显微镜追踪T淋巴细胞对外泌体的摄取情况。通过CyTOF方法检测对照组T细胞(Control T cells,Ctrl-T)外泌体刺激T细胞(Exosomes stimulated T cells,Exo-T)免疫相关蛋白的表达及免疫表型的分布。使用流式细胞术及组织切片免疫荧光染色方法在胰腺癌患者外周血及手术切除肿瘤组织中检测T细胞PD-1蛋白的表达情况。通过转录组测序和基因集合富集分析方法检测Exo-T的基因表达及信号通路变化。采用ELISA、流式细胞术检测Exo-T的生物学功能改变。采用RT-q PCR、Western Blot和流式细胞术验证p38 MAPK及内质网应激在外泌体诱导T细胞凋亡中的作用。采用Western Blot、流式细胞术、免疫组化、免疫荧光、免疫荧光结构照明等方法验证胰腺癌细胞和组织中Treg相关免疫抑制性分子的表达,并阐明ATM-AMPK-SIRTs-FOXOs信号轴在胰腺癌外泌体诱导调节性T细胞中的作用。结果我们发现使用超速离心法从胰腺癌细胞培养上清中提取的细胞外囊泡大小在50-120 nm之间,粒径分布在114±15nm区间,表达CD9、CD63和HSP70蛋白,证明所提取的细胞外囊泡为外泌体。共聚焦显微镜捕获td Tomato标记的T淋巴细胞,表明T淋巴细胞摄取胰腺癌来源外泌体。RTCA-DP实时无标记细胞分析系统测定Exo-T的杀肿瘤效应下降。CyTOF结果提示经外泌体刺激后,T细胞富集了以Treg为主的免疫抑制性表型,主要表达CD25、FOXP3、PD-1、CTLA4及Tim-3等免疫抑制性分子。其中PD-1的高表达在胰腺癌患者外周血和肿瘤组织中得到进一步验证。转录组测序及基因集合富集分析结果提示凋亡通路、未折叠蛋白反应通路、代谢通路、DNA损伤修复通路及TGF-β信号通路在Exo-T中富集。其中外泌体刺激后T细胞凋亡水平的上升和Treg表型的扩增经流式细胞术进一步验证。经流式细胞术和Western Blot检测,我们发现MAPK相关蛋白p38 MAPK、内质网应激相关蛋白PERK、e IF2α、ATF4和凋亡相关蛋白CHOP在外泌体诱导T淋巴细胞凋亡中的作用。进一步分析代谢通路、DNA损伤修复通路及TGF-β信号通路相关分子在Exo-T中的上下游关系,我们发现外泌体刺激后T细胞中ATM蛋白、AMPK蛋白和SIRT家族的SIRT1、SIRT2、SIRT6蛋白依次激活,继而促使转录因子FOXO1A和FOXO3A的表达上调和核定位,最终导致FOXP3蛋白高表达、TGF-β1细胞因子分泌增加以及T细胞杀肿瘤效应减弱。结论胰腺癌细胞与免疫细胞之间存在竞争关系,而免疫微环境决定了这一竞争的结果。胰腺癌细胞来源的外泌体在免疫调节中起重要作用:1.通过p38MAPK-ER-stress途径诱导T细胞凋亡;2.通过上调PD-1、PD-L1、Tim-3、IL-10、TGF-β1等免疫抑制性分子来抑制T细胞抗肿瘤效应;3.通过ATM-AMPK-SIRTs-FOXOs信号轴诱导Treg表达上调以介导免疫逃逸。