研究背景与目的肝细胞癌/原发性肝癌（简称肝癌）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,具有病情隐蔽、早期诊断率低、放化疗效果差、预后不良等特征。研究肝癌的发生发展及其机制,寻找肿瘤细胞恶性增殖过程中起着重要调控作用的靶点对于肝癌的防治具有重要意义。TRIM家族是一类具有E3泛素连接酶活性的蛋白,它们在调控细胞凋亡、周期、病毒免疫应答、分化以及肿瘤发生等过程中起重要作用。TRIM47是一个具有E3连接酶活性和原癌基因特征的TRIM家族成员,参与调控多种恶性肿瘤的发生发展。本论文旨在深入探究TRIM47在肝癌中的作用及其分子机制,从而为临床上肝癌的防治及寻找新的药物靶标提供理论依据和新思路。实验方法及结果1.基于多个数据库分析表明TRIM47与肝癌的发生发展密切相关在多个肿瘤数据库中展开TRIM47与HCC相关性的分析,结果显示:肝癌组织中的TRIM47的m RNA表达水平高于正常肝组织,且与肝癌患者的临床分期及肿瘤分级呈正相关。结果还显示,TRIM47表达水平越高,肝癌患者总生存期越短,并且TRIM47的基因突变能明显影响患者的总生存期。此外,TRIM47表达水平也与肝癌患者的淋巴结转移、肿瘤组织学亚型、性别呈不同程度的相关性。2.临床肝癌患者组织芯片分析证实TRIM47在肝癌细胞中的表达显著高于癌旁组织组织芯片（上海芯超公司提供）免疫组化实验分析得出结论:TRIM47在肝癌组织中的蛋白表达水平显著高于癌旁组织。为了进一步研究其生物学功能,我们运用蛋白质免疫印迹和实时荧光定量PCR技术检测了Huh7、Hep G2、Hep3B三种不同肝癌细胞系中TRIM47的蛋白及m RNA表达水平,并与HK-2、293T两种正常上皮细胞株作比较,发现TRIM47在肝细胞癌中蛋白与m RNA水平呈现高表达,表明临床样本的结果与数据库的分析结果一致。3.干扰或过表达TRIM47的稳转细胞株证明TRIM47参与肝癌的发生发展过程研究选择TRIM47表达水平最高的Huh7细胞株转染两种TRIM47 si RNA并通过细胞计数和划痕实验对TRIM47的生物功能进行了初步研究。为了深入研究TRIM47在肝癌中的作用,我们利用慢病毒感染体系构建了稳定干扰TRIM47表达的Huh7和Hep G2细胞株。同时,在TRIM47表达量较低的Hep3B细胞中构建了过表达TRIM47的稳转细胞株。1)干扰TRIM47明显抑制肝癌细胞的增殖和迁移:细胞增殖观察、CCK-8细胞活性检测实验、集落形成以及划痕、Transwell小室迁移等实验证明,干扰TRIM47显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移,而过表达TRIM47则可促进肝癌细胞的生长和迁移。EMT相关指标蛋白水平变化的趋势进一步证实干扰TRIM47可降低肝癌细胞的迁移能力,部分指标m RNA趋势与其蛋白表达水平一致,表明干扰TRIM47的表达也可能会影响部分EMT相关蛋白的转录。2)干扰TRIM47显著抑制肝癌细胞周期及促进肝癌细胞凋亡:细胞周期检测、细胞凋亡实验（生理/DOX诱导）以及流式分析仪检测显示:干扰Huh7和Hep G2细胞株的TRIM47表达可阻滞肝癌细胞的细胞周期G1/S期,促进肝癌细胞的凋亡。检测细胞凋亡相关蛋白水平的变化趋势进一步印证了这一结论。荧光实时定量PCR也检测到细胞周期相关基因的m RNA水平皆有不同程度的下降,部分细胞凋亡基因的m RNA改变趋势与其蛋白水平一致。3)TRIM47促进肝癌发生发展的可能分子机制:Western Blot检测结果表明,肝癌细胞株Huh7、Hep G2和Hep3B的内源性PLK1蛋白水平显著高于正常上皮细胞株HK-2;干扰Huh7和Hep G2肝癌细胞株TRIM47表达可抑制PLK1的表达;用蛋白合成抑制剂（CHX）处理TRIM47干扰的稳定细胞株Huh7,并通过蛋白半衰期实验发现,TRIM47可抑制肝癌细胞PLK1蛋白的降解。免疫共沉淀实验表明,TRIM47可与PLK1相互作用。以上结果表明TRIM47很可能是通过稳定PLK1的蛋白水平,促进肝癌细胞的增殖和迁移。结论1.TRIM47在肝癌组织中表达显著上调,并与患者的临床预后相关;2.TRIM47能够促进肝癌细胞的增殖、迁移和集落形成;3.TRIM47能促进肝癌细胞的细胞周期,并抑制细胞凋亡;4.TRIM47能与PLK1发生互作并抑制其蛋白的降解,进而促进肝细胞癌的发生发展。以上结果提示:TRIM47有望成为一个潜在的肝癌早期诊断与预后评估的生物标志物以及治疗肝癌的药物靶点。