论文部分内容阅读
甲醛是主要室内空气污染物，可能引起人体急性或慢性中毒。通过植物来去除甲醛污染是最简单、最自然、最环保的方式，但是植物吸收和代谢甲醛的能力远不能达到实际使用的要求。本研究在烟草中过表达抗甲醛真菌Aspergillus nomius SGFA1中的依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶基因（Anfaldh），尝试利用基因工程的方法来提高植物去除甲醛的能力。主要研究内容如下： 1.构建pBI121-Anfaldh植物表达载体，并对植物进行遗传转化 构建了植物过表达载体pBI121-Anfaldh。通过农杆菌介导法转化烟草，对50株卡那霉素筛选得到的植株进行PCR鉴定，得到27株PCR阳性植株。 2.转基因植株的分子生物学鉴定 对转基因植株进行qPCR鉴定，结果发现转基因植株的Anfaldh基因表达量是野生型（WT）的3.6-14倍，其中三个转基因株系（Anfaldh4、Anfaldh40、Anfaldh130）具有较高的转录水平，其中转基因植株Anfaldh4的基因表达量最高。 3.转基因植株的FALDH酶活性分析 通过酶活性检测分析显示，在340 nm波长下，转基因植株在单位时间内能产生更多的NADPH。Anfaldh4、Anfaldh40、Anfaldh130、WT中FALDH酶活性分别为0.429、0.392、0.345和0.195 U/mg蛋白。转基因植株的酶活性均有一定程度的提高，是WT的1.8-2.2倍，结果表明Anfaldh基因在转基因株系中过量表达，且产物具有生物活性。 4.甲醛胁迫下转基因植株的表型检测 在含4 mM甲醛的平板上，处理3天后WT植株全部白化死亡，转基因植株能够正常生长。处理6-7天后，转基因植株叶片开始膨大，最终转基因植株能够分化获得不定芽。用4 mM气体甲醛处理3天，转基因植株表现出比野生型植株更好的生长。WT几乎所有的叶子变黄枯萎，而大多数转基因植株的叶片仍然保持绿色，说明Anfaldh过表达植株降解甲醛能力强于WT。 5.甲醛胁迫下转基因植株的生理检测 甲醛胁迫下，丙二醛含量明显上升，但转基因植株的丙二醛（MDA）含量显著低于WT。在叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白含量方面，转基因植株均高于WT。生理水平分析表明Anfaldh过表达植株对HCHO胁迫的耐受性强于野生型植株。 6.转Anfaldh基因烟草的代谢甲醛能力检测 在2 mM甲醛水溶液中，处理72 h后，转基因植株Anfaldh4将水溶液中93％的甲醛代谢完全，而WT植株甲醛水溶液中仍有62%甲醛剩余。和WT植株相比，转基因植株的甲醛代谢能力是WT的1.4-2.5倍。在气体甲醛环境中，转基因植株的单位面积代谢气体甲醛的能力是野生型的1.9-2.37倍。甲醛吸收实验证明，转基因植株的吸收甲醛能力强于WT植株。