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生物柴油是生物质能的一种形式，具有能耗低、绿色、可再生等优点，能够缓解石油即将枯竭和环境污染对人类造成的危机，成为国内外研究开发的热点。和传统的化学催化法相比，脂肪酶法合成生物柴油条件温和、工序简单、能耗低、绿色环保。但是由于脂肪酶成本高，有机溶剂对脂肪酶有毒性，脂肪酶具有催化特异性等因素的影响，使酶法生产生物柴油难以进一步扩大生产规模。本论文主要对脂肪酶产生菌的筛选，脂肪酶基因的克隆表达，定向进化，脂肪酶大规模提取和酶法生产生物柴油进行了研究，旨在获得适合于催化制备生物柴油的脂肪酶。主要研究结果如下：1采用吐温80平板筛选法和罗丹明B平板筛选法从土壤中分离得到109株脂肪酶产生菌，从油菜内生菌中获得57株脂肪酶产生菌，从海洋微生物中获得58株脂肪酶产生菌，建立了小型脂肪酶产生菌菌种库。通过摇瓶复筛获得脂肪酶高产菌株37株。利用薄层层析法跟踪脂肪酶水解甘油三酯过程，根据产物判断脂肪酶催化位置特异性，得到一株催化位置非特异性脂肪酶产生菌T6，经形态，生理生化和分子生物学鉴定该菌株为Proteus vulgaris。利用苯和甲苯为唯一碳源，并研究了脂肪酶对不同极性有机溶剂的耐受性，获得耐有机溶剂脂肪酶产生菌M36，经形态、生理生化和分子生物学鉴定该菌株为Staphylococcus saprophyticus。菌株M36产生的脂肪酶在1/4（v/v）的甲醇和乙醇中37℃，200rpm，30min后残留脂肪酶活力分别为32％和36％。2参考Genbank中Proteus Vulgaris脂肪酶基因序列（编号U3348）设计引物，PCR扩增获得了普通变形杆菌T6脂肪酶基因，与U33485序列进行比对，发现有3个碱基发生了变化，55 A-G、87 T-G、285 C-T，都是沉默突变。构建了含有肠毒素ST-Ⅱ信号肽，在N端添加了His6标签的表达载体pLLP-STⅡ-PL1。含有表达质粒pLLP-STⅡ-PL1的菌株E．coli TOP 10F’在100μg/ml IPTG的诱导表达后，His6-T6脂肪酶主要存在于周质中。用Ni-NTA His Tag Kit一步纯化His6-T6脂肪酶，纯化倍数达到4倍，回收率达到83.79％。比活为7011.23 U/mg。His6-T6脂肪酶酶学最适pH为9.0，在pH为7.0-11.0时比较稳定，有82％的催化活性：最适温度为50℃，当t≤40℃时，可以保持99％的脂肪酶活力。具有催化位置非特异性，不耐有机溶剂。3运用Error-PCR和DNA shuffling技术对Proteus Vulgaris T6脂肪酶进行定向进化，通过一轮Error-PCR和三轮DNA shuffling，获得了酶活性提高5.8倍的突变子EF3.3，比活力为47600U/mg纯化蛋白。EF3.3有三个氨基酸发生突变：102位Val突变成Ile，197位Gly突变成Ser，229位Arg突变成His。预测蛋白质三级结构，发现102位和197位氨基酸残基分别位于底物的结合部位，氨基酸突变提高了酶与底物的结合能力，从而提高了脂肪酶活性。另外，102位Val突变成Ile后，与Ser 79形成氢键的键长增大0.1A，由2.92增大到2.93 A。键长增大，作用力减小，使Ser阴离子更容易攻击底物，完成底物的酰基化，提高酶催化速度。229位Arg突变成His，可能对α-螺旋结构形成的“盖子”的作用力减小，有利于“盖子”的打开，容易发生界面激活作用而提高酶活。EF3.3表达质粒在传代50代后依然稳定。突变体EF3.3诱导表达最优条件为28℃，150rpm，100μg/ml IPTG诱导1.5h。纯化突变酶EF3.3大小为31.5 KDa，和野生型脂肪酶酶学性质相比，只是在pH 5.8范围内酶活性增强，温度、有机溶剂、非特异性没有发生改变。4比较了PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000做为双水相聚合物使对突变脂肪酶EF3.3和背景蛋白分配的影响，确定PEG相对分子量为2000时，对纯化分离脂肪酶效果最好。研究相浓度，pH和KCl对脂肪酶在PEG2000/磷酸盐双水相体系分配的影响，获得了最佳PEG2000/磷酸盐体系为：组成为PEG17.5％/磷酸盐12.5％，pH7.0，1.5％KCl。此时分配系数、纯化系数和酶回收率分别为6.5、5.8、89％。5以菜籽油为原料采用EF3.3游离脂肪酶催化酷交换制备生物柴油。结果表明，甲醇浓度和添加方式、脂肪酶用量、反应温度、有机溶剂转速和硅胶添加量对产率有明显的影响。最佳反应条件为：40℃，125rpm，酶添加量为7.5％，甲醇分三批加入，每次加入与菜籽油等Mol的甲醇，0.1Mol正己烷，1.0g硅胶，反应36h，甲酯转化率为80％。