背景心脏重构是指心脏受到各种内外刺激后,心脏形态、结构和功能等出现一系列适应性改变,其病理特点主要包括心肌肥厚及间质纤维化等,其病理机制主要涉及神经内分泌系统的激活。心脏重构早期为代偿性适应,晚期失代偿可发展为慢性心衰(congestive heart failure, CHF),而CHF是全球人群病死率的一个主要原因。因此,在临床中,抑制心脏重构是治疗CHF的重要策略,如p受体阻滞剂、肾素-血管紧张素-醛固酮系统拮抗剂等抑制神经内分泌系统药物的使用,对预防心脏重构、治疗CHF均取得一定效果。但CHF的发病率和病死率仍居高不下,因此研究心脏重构分子机制及干预药物具有必要性。高胆固醇血症被认为是心血管疾病,尤其是冠心病的主要危险因素之一,它可增加全因死亡率,其负面临床意义已得到反复证实。既往研究提示高胆固醇血症是引起左心室肥厚的独立危险因素,在心脏重构的发病及进展中起重要作用。载脂蛋白E基因缺陷(ApoE-/-)小鼠是被广泛用作研究高胆固醇血症、动脉粥样硬化性等疾病的动物模型,ApoE-/-除有血管表型外,还有如心脏质量增加、室壁厚度增加、心肌纤维化和心功能减低等心脏表型改变。关于ApoE-/-小鼠心脏重构的机制以及相关干预措施的研究很少。同时,高胆固醇血症对心肌细胞的再生、老化、凋亡以及P53信号转导通路的影响也知之甚少。黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ, AST Ⅳ)是从中药黄芪中分离出来的一种羊毛脂醇型四环三萜天然单体皂苷,具多重抗心血管疾病药理活性,既往研究证实AST Ⅳ可以抑制病毒感染、缺血缺氧等引起的心脏重构,降低心肌细胞凋亡率,减轻心肌纤维化,抗氧化应激等。然而,AST Ⅳ对高胆固醇血症引起的心脏重构的影响及可能机制的研究尚无。因此,本研究目的是观察AST Ⅳ干预ApoE-/-小鼠心脏重构的疗效及探索其相关机制。目的验证假说：高胆固醇血症可引起心肌细胞增殖能力改变,促进心肌细胞老化、凋亡和心肌纤维化,影响P53信号转导通路的激活状态,最终导致以心肌肥厚、心功能下降为特点的病理性心脏重构;而AST Ⅳ治疗能抑制高胆固醇血症所致的心脏重构,进而改善心功能。方法1. AST-Ⅳ准备AST Ⅳ的纯度≥98%,羟丙基-β-环糊精溶解为浓度1%和10% AST Ⅳ溶液。2.动物分组雄性ApoE-/-小鼠随机分为高脂模型组(KO,n=14),低浓度AST Ⅳ干预组(AST-LD,n= 7),高浓度AST Ⅳ干预组(AST-HD, n= 8),以同龄同性别野生型C57BL/6J小鼠(WT,n=15)为对照组。8周龄时,分别获取WT(n=8)和KO(n=7)组小鼠治疗前各参数的基线水平。此后,AST-LD和AST-HD组分别隔日腹腔注射1mg/kg和10mg/kg的AST Ⅳ,余组以同方式同时长给予等剂量溶剂,SPF级普食喂养。药物干预8周(即小鼠16周龄),心脏超声检查后处死小鼠,取血及心脏标本,保存待检。3.心脏超声、血脂和心脏质量检测小鼠麻醉后,超声检测左室内径及后壁厚度,计算左室射血分数和缩短分数。禁食不禁饮12小时,称重后取血处死,分离血浆以测血脂四项；取心脏标本,测量心脏质量和左心室质量,随后垂直于心脏纵轴将左心室分为两部分,一部分用置于包埋剂用作冰冻切片,另一分部保存于超低温冰箱后期备用。4.心肌纤维化,免疫荧光染色法,心肌细胞尺寸和数量的检测马松染色检测心肌纤维化。免疫荧光染色检测各目标蛋白在心脏组织中的表达。使用心肌肌钙蛋白Ⅰ单抗标记心肌细胞；检测目标蛋白如与心脏的氧化应激相关蛋白尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4),抗氧化应激相关蛋白超氧化物歧化酶1、2(SOD1、2),细胞增殖相关蛋白Ki67,细胞老化相关蛋白P16 INK4a。参考文献方法测量心肌细胞尺寸和数量。5.末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)检测细胞凋亡细胞死亡原位检测试剂盒(荧光标记法)用于检测心肌细胞的凋亡。6.实时荧光定量聚合酶链式反应(QRT-PCR)检测心脏基因转录表达情况从心脏组织提取总RNA,逆转录成cDNA, QRT-PCR法检测与细胞生长周期、增殖、老化、P53信号转导通路、氧化应激等相关基因mRNA的表达。结果1.血脂四项:ApoE-/-小鼠在8周龄时已进展为高胆固醇血症(TC和LDL-C较WT组分别上升3.7倍和8.7倍,甘油三酯(TG)不增高,HDL-C浓度较WT组下降23%)。16周龄时,ApoE-/-小鼠血脂变化趋势类似。AST Ⅳ治疗ApoE-/-小鼠8周后,血浆TC和LDL-C浓度较KO组上升,提示本实验中未观察到ASTⅣ有降血浆胆固醇作用。2.心脏质量和尺寸：ApoE-/-小鼠8周龄时心脏较WT组已表现为心肌肥厚,其心脏质量(HW,1.1倍)、左心室质量(LVW,1.3倍)、心脏质量体重比(HW/BW,1.1倍)、左心室质量体重比(LVW/BW,1.3倍)以及左心室质量心脏质量比(LVW/HW,1.2倍)均显著增加,左心室长轴(LAX)也增加1.1倍。16周时这些参数的差异仍然维持,AST IV治疗8周后,这些参数在AST-HD组较KO组分别下降了HW 24%、LVW 28%/HW/BW 8%、LVW/BW 10%、LVW/HW 5%、 LAX 10%; AST-LD组没有显著改变。3.心脏超声检测结果：与上述心脏质量和尺寸的变化趋势一致。8周龄时ApoE-/-小鼠较WT组左室舒张末期内径(LVDd)增加14%,左室收缩末期内径(LVDs)增加11%,左室舒张末期容积(LVEDV)和左室收缩末期容积(LVESV)分别增加39%和30%。16周时,除LVDs外,ApoE-/-小鼠LVESV较WT组增加至35%,左室射血分数(LVEF)、缩短分数(FS)、舒张期末左室后壁厚度(LVPWd).收缩期末左室后壁厚度(LVPWs)分别下降11%、13%、13%、6%。提示高胆固醇血症小鼠心脏室壁厚度变薄和收缩功能受损变化。经AST IV治疗后,AST-HD组小鼠LAX减小,LVESV恢复,EF由54%上升至60%,FS由28%上升至31%。AST-LD组较KO组在心脏超声方面并没有显著差异。4.心脏纤维化：8周龄ApoE-/-小鼠较WT组左心室胶原蛋白含量没有差异,但16周时胶原蛋白分数是WT组2倍,高剂量AST Ⅳ治疗后,胶原蛋白分数减低至KO组一半。提示高胆固醇血症易致心脏纤维化,AST Ⅳ具有明显抑制心脏纤维化作用。5.心肌细胞体积和数量：8周龄ApoE-/-小鼠较WT组心肌细胞体积增加19%,心肌细胞数量无改变；16周,心肌细胞体积增加了38%,心肌细胞数量减少了14%。而AST-LD和AST-HD组小鼠的心肌细胞体积较KO组的分别减低了19%和27%,AST-HD组小鼠的心肌细胞数量较KO组相比增加了10%。6.增殖、老化蛋白的表达：8周龄ApoE-/-小鼠较WT组ki67阳性心肌细胞数占心肌细胞总数比例基本相等,16周时该比例减至WT组的80%,而高剂量AST Ⅳ治疗后该比例较KO组增加3倍,ki67阳性细胞占整个心脏细胞总数比例增加2倍。其次,8周龄ApoE-/-小鼠较WT组在p16INK4a阳性心肌细胞数占心肌细胞总数比例无差异,16周时,该比例增为WT组的2.9倍,而低剂量和高剂量AST Ⅳ治疗后该比例较KO组分别减低了39%和60%。ki67阳性细胞占整个心脏细胞总数比例显著减低55%。7.心脏细胞凋亡：8周龄ApoE-/-小鼠心肌细胞凋亡(<2%)与WT组无差异。16周龄ApoE-/-小鼠凋亡心肌细胞数占总心肌细胞数比例超过WT组的23倍。AST-LD和AST-HD组的心肌细胞凋亡较KO组分别减少了87%和90%。凋亡阳性细胞占心脏细胞总数比例呈类似变化规律。8.氧化应激和抗氧化应激：8周时ApoE-/-小鼠较WT组心脏NOX4阳性细胞占心脏细胞总数比例、SOD1和SOD2的阳性表达面积均无显著改变；16周时,ApoE-/-小鼠NOX4阳性细胞占心脏总细胞比例是WT组的1.3倍,同时SOD2的阳性表达面积显著减小,SOD1相对表达面积没有显著差异。AST-LD和AST-HD组的NOX4阳性细胞占心脏总细胞比例较KO组分别降低16%和17%,SOD1和SOD2的表达则均无显著改变。9.目的基因转录：本实验检测了细胞周期、增殖、老化和P53信号转导通路和氧化应激相关基因表达的情况。1)8周时,ApoE-/-小鼠较WT组Cyclin D1(2.2倍)和MCM5(2.7倍)上调,CDKN1A (70%)和CDKN1B (28%)下调,其余细胞周期相关基因在转录水平均无显著改变。16周时,ApoE-/-小鼠较WT组反映细胞生长停滞的基因CDKN1A(7倍)、CDKN1B(2.7倍)、CDKN2A(9.6倍)明显上调,其中CDKN2A上调与前述翻译产物p16INK4a蛋白质表达变化一致,而CDK4(2.2倍),Cyclin B1(11.3倍).,Ki67(4.7倍)和MCM5(3.6倍)显著上调,其中Ki67mRNA表达与前述蛋白表达不完全一致。AST Ⅳ治疗后CDKN1A, CDKN1B, CDKN2A, MCM5, Cyclin B1、D1、E1、A2和CDK4在AST-LD和AST-HD两组均显著下调。2)8周时,ApoE-/-小鼠心脏除P53上调(1.6倍)和Mcl1下调(27%)之外,其余检测的P53信号转导通路相关基因(TP53、Bax、Bcl2、caspase-3、 Mdm2、ATM、GADD45A)较WT组没有显著差异；16周时除Bax和GADD45A外,其余检测基因表达上调了2.5倍以上。AST IV治疗后上述基因表达显著下调。3)8周时,ApoE/-小鼠心脏与氧化应激相关基因(Duox1、Srxn1、NOX1、 NOX4、GPX2、SOD1)表达较WT组无显著改变；16周时,除Duox1和SOD1外,余检测基因均出现了不同程度的上调,AST Ⅳ治疗后较KO组显著下调。结论本研究中观察到ApoE-/-小鼠心肌细胞增殖能力减低,细胞老化、凋亡加重,心肌纤维化和心脏中P53信号转导通路相关基因表达增高,这些与高胆固醇血症小鼠发生心肌肥厚、心脏收缩功能下降等病理性心脏重构相关；AST Ⅳ治疗并没有降低ApoE-/-小鼠血脂浓度,但逆转其心脏重构、改善心功能,与其促进心脏组织的增殖相关蛋白Ki67表达增加,减少老化相关蛋白p16INK4a表达,抑制心肌细胞凋亡和心肌纤维化,调控心脏P53信号转导通路相关基因的表达有关。本研究为AST Ⅳ应用于临床上治疗血脂异常相关的心脏重构提供了新的思路。