牛乳铁蛋白(Bovine lactoferrin,bLF)是牛乳中一种重要的碱性蛋白,相关基础与应用研究已引起广泛关注.牛乳铁蛋白作为一种新型的骨生长因子,通过调节骨的生长和代谢过程发挥其功能,促进骨骼生长.本研究采用MTT法进行成骨细胞增殖实验,通过流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、蛋白质组学、RT-PCR、Westernblot、基因沉默以及分子垂钓等技术研究成骨细胞对牛乳铁蛋白的内吞作用以及牛乳铁蛋白对成骨细胞MAPK信号通路的调控作用,考察不同浓度的牛乳铁蛋白对成骨细胞和破骨细胞共培养体系的影响.
　　本研究首先通过MTT法以及流式细胞仪荧光标记的方法,研究了不同浓度的牛乳铁蛋白(20μg/mL、100μg/mL和500μg/mL)在作用成骨细胞不同时间点后对成骨细胞增殖作用的影响,结果表明牛乳铁蛋白能显著增强MC3T3-E1成骨细胞增殖.牛乳铁蛋白对成骨细胞的增殖作用还体现在其可扰乱正常的细胞周期,主要表现在促使细胞从G0/G1期向S期和G2/M期转化,即增加S和G2/M期细胞的比例.通过RT-PCR、Westernblot以及ELISA的方法研究了不同浓度的牛乳铁蛋白对成骨细胞MAPK信号通路基因水平、蛋白水平以及细胞因子的调控作用,发现了牛乳铁蛋白可以刺激ERK,JNK和p38MAPK.牛乳铁蛋白处理后MAPK的mRNA表达显著增强,同时提高ERK和p38MAPK的磷酸化水平并促进其激活,降低JNK的磷酸化水平阻止其激活,同时牛乳铁蛋白使成骨细胞中c-Fos和c-Jun表达分别增强了3.26倍和25.79倍.这些结果表明牛乳铁蛋白是通过刺激ERK,JNK和p38MAPK调控c-Fos和c-Jun的分泌从而诱导成骨细胞增殖.
　　通过流式细胞仪以及激光共聚焦显微镜技术研究牛乳铁蛋白与成骨细胞的内吞作用,随着作用时间的延长,牛乳铁蛋白逐渐与成骨细胞结合,经过内吞作用进入到细胞内部.通过分子垂钓技术发现牛乳铁蛋白与位于成骨细胞膜的CKAP4蛋白有较高的亲和性,证明牛乳铁蛋白的成骨活性可能是通过与这种蛋白的结合来实现的.进一步通过基因沉默技术证明了CKAP4可作为牛乳铁蛋白的受体内吞进入成骨细胞内部,从而介导牛乳铁蛋白对成骨细胞增殖活性的影响.
　　通过蛋白质组学的方法研究了牛乳铁蛋白作用成骨细胞后,对于成骨细胞内总蛋白的影响,结果表明牛乳铁蛋白调控成骨活性相关的GO注释上调蛋白有22个,下调蛋白10个.牛乳铁蛋白调控成骨活性相关的KEGG途径相关上调蛋白6个,下调蛋白1个.其中MAPK信号通路总蛋白并未发生明显变化,但是促进了能够调节MAPK信号通路中ERK磷酸化的上游细胞生长因子的表达,进一步证明了牛乳铁蛋白是通过调节MAPK信号通路蛋白磷酸化水平来调节激活信号通路的.
　　研究发现不同浓度的牛乳铁蛋白对RAW264.7细胞的增殖没有显著的抑制作用,对细胞无毒性.牛乳铁蛋白具有呈剂量依赖关系地抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞形成破骨细胞的能力,也可以剂量依赖性方式显著抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞形成破骨细胞的活性,同时不同浓度的牛乳铁蛋白均对破骨细胞的功能有直接的抑制作用.进一步通过采用种属来源一致的成骨细胞MC3T3-E1与破骨前体细胞RAW264.7以1:1的比例直接接触的共培养方式,研究不同浓度的牛乳铁蛋白对于共培养体系的影响.结果表明,低浓度的牛乳铁蛋白能够抑制成骨细胞的ALP活性,而中高浓度的牛乳铁蛋白能够显著地促进成骨细胞的ALP活性.对于破骨细胞,则发现了低中浓度的牛乳铁蛋白能够促进破骨细胞的TRAP活性,而高浓度的牛乳铁蛋白能够显著地抑制破骨细胞的TRAP活性以及骨吸收功能.
　　本研究通过阐述不同浓度的牛乳铁蛋白促进成骨细胞增殖活性的影响机制以及对破骨细胞与成骨细胞共培养体系的影响,说明了牛乳铁蛋白可以通过调节成骨细胞与破骨细胞的方式来调控骨的生长代谢.这些结果进一步表明了牛乳铁蛋白用于预防并治疗以破骨细胞活性过度表达为特征的骨骼疾病如骨质疏松症等具有良好的应用前景,为牛乳铁蛋白相关产品开发奠定了一定的理论基础.