目的:铜绿假单胞菌是一种革兰阴性条件性致病菌,易在长期住院患者特别是肺部囊性纤维化病人中引起慢性持续性感染。感染致病过程中,该菌可表达多种毒力因子——细菌表面的毒性因子(菌毛、鞭毛、脂多糖、藻酸盐等)和细菌分泌至胞外的毒素(碱性蛋白酶、外毒素A、弹性蛋白酶、磷脂酶、绿脓菌素以及III型分泌系统分泌的效应蛋白等),在医院感染病原体中居于首位。细菌的致病能力可受到外界环境变化的影响,维持菌体内环境稳态有助于细菌毒力因子的完整表达。研究表明ClpP蛋白酶对维持细菌在应激条件下的内环境稳态发挥着重要的作用。ClpP蛋白酶由clpP基因编码,最初在大肠埃希菌中发现,与调节亚基ClpX或ClpA结合形成复合物,后者可识别未折叠蛋白特定的多肽序列,并将这些蛋白转运至ClpP蛋白酶水解成小分子肽,从而降解及清除细菌在应激状态下产生并堆积的不可逆损伤蛋白,维持菌体内环境稳态。大肠埃希菌和肠杆菌科的ClpP蛋白酶可调节Ⅲ型分泌系统及其它毒力因子的表达,影响细菌致病。而ClpP在铜绿假单胞菌中的作用却鲜有报道,由于铜绿假单胞菌的ClpP蛋白酶与大肠埃希菌具有70%的同源性,因此我们推测铜绿假单胞菌的ClpP蛋白酶与大肠埃希菌ClpP蛋白酶具有相似的生物学功能,对该菌毒力因子的表达也具有一定的调控作用。为此,本研究拟构建铜绿假单胞菌PAO1的clpP基因缺陷株和过表达菌株,对III型分泌系统效应蛋白基因的表达、绿脓菌素产量、运动能力、生物膜等毒力因子进行测定,初步探讨clpP基因在铜绿假单胞菌毒力中的作用。方法:(1)PCR扩增clpP基因同源臂与庆大霉素抗性基因(GN)插入自杀质粒pEX18-Tc,构建clpP基因敲除载体,转化铜绿假单胞菌PAO1,构建clpP基因缺陷株ΔclpP。(2)PCR扩增clpP基因开放读码框(clpP-C),插入pBBR1MCS-2质粒lacZ启动子的下游,构建clpP基因表达载体,转化ΔclpP,构建clpP基因过表达菌株s-clpp。(3)用trizol抽提铜绿假单胞菌的总rna,real-time荧光定量pcr检测野生株、clpp基因缺陷株及clpp基因过表达菌株Ⅲ型分泌系统效应基因exos、exot和exoy的表达情况。(4)采用氯仿抽提绿脓菌素,520nm处测吸光度以检测野生株、clpp基因缺陷株和clpp基因过表达菌株产绿脓菌素量的变化。(5)采用运动能力检测专用培养基检测野生株、clpp基因缺陷株和clpp基因过表达菌株的三种运动情况(蜂群、泳动和蹭行)。(6)体外培养铜绿假单胞菌72h形成生物膜,结晶紫染色后用荧光相差显微镜观察野生株、clpp基因缺陷株及clpp基因过表达菌株变化。(7)以生长时间为横坐标,od600值为纵坐标绘制生长曲线,观察野生株、clpp基因缺陷株和clpp基因过表达菌株的生长情况。(8)平板生存实验以lb(ph7.0)平板上生长的菌落数为对照,通过比较生长于含有一定浓度h2o2、nacl和盐酸的lb平板上的菌落数,观察野生株、clpp基因缺陷株及clpp基因过表达菌株对h2o2、nacl和酸的耐受能力。结果:(1)酶切、pcr及测序结果表明,clpp基因敲除载体构建正确,将其导入野生株后,成功构建铜绿假单胞菌clpp基因缺陷株Δclpp,测序结果表明,clpp基因37bp~453bp缺失。(2)酶切、pcr及测序结果表明,clpp表达质粒pbb-clpp构建正确,将其导入Δclpp后,成功构建铜绿假单胞菌clpp基因过表达菌株s-clpp。(3)real-time荧光定量pcr检测结果显示,Δclpp的t3ss效应基因exos、exot和exoy的表达量较野生株分别下降了32.2%、52.4%和57.7%,而s-clpp的表达量分别是野生株的4.11倍、7.11倍和4.25倍。(4)clpp基因缺陷株产绿脓菌素的含量约为野生株的一半,而clpp基因过表达菌株产绿脓菌素的量约为野生株的2.5倍。(5)clpp基因缺陷株三种运动能力均较野生株减弱,而clpp基因过表达菌株的三种运动能力均可恢复至野生株水平。(6)铜绿假单胞菌在模拟流动环境中培养72h后形成生物膜,与野生株相比,clpP基因缺陷株形成生物膜的能力大为减弱,而clpP基因过表达菌株形成生物膜的量与野生株相当。(7)37℃培养铜绿假单胞菌达7h并绘制生长曲线发现,clpP基因缺陷株在对数生长期生长速度明显较野生株缓慢,而进入平台期后生长速度相互接近,但是clp P基因过表达菌株与clpP基因缺陷株的生长并未有明显差别。(8)clpP基因缺陷株对H2O2、NaCl和酸的抵抗能力明显下降,而clpP基因过表达菌株抗氧化应激能力与野生株相当。结论:clpP基因在铜绿假单胞菌毒力中发挥着重要作用,参与并调节Ⅲ型分泌系统效应基因的表达、产绿脓菌素、运动能力、生物膜形成以及抗氧化应激能力。