丝状真菌有生产和分泌外源蛋白的巨大潜力,随着研究的不断深入,其蛋白表达的一些重要特性已逐渐被人们所认识,包括表达量大、胞外分泌率高、蛋白质分子折叠和修饰系统接近高等真核细胞、生产的外源蛋白具有天然活性等。米曲霉(Aspergillus. oryzae)和泡盛曲霉(Aspergillus. awamori)是工业上用于外源蛋白表达的重要生产菌株。丝状真菌作为宿主表达外源蛋白,尤其是非丝状真菌蛋白时,其分泌效率往往不尽如人意,产率一般比表达同源蛋白低2到3个数量级,另外,丝状真菌转化效率低也在一定程度上制约了其在工业上的应用。随着分子遗传技术的发展,可以利用基因工程方法对丝状真菌进行有目的的遗传改造,以提高外源蛋白的表达量。本研究首先进行了野生宿主菌抗性标记的筛选,研究了吡啶硫胺素(PT)对米曲霉IFO4177生长的影响以及潮霉素B对米曲霉IFO4177和泡盛曲霉CBS115.52生长的影响。结果表明,PT可以很大程度上抑制米曲霉的生长,可以利用PT抗性基因(ptrA)构建野生型米曲霉转化体系;潮霉素B对米曲霉有一定的抑制作用,而100μg/mL潮霉素B即可抑制泡盛曲霉的生长,因此可以利用潮霉素抗性基因构建转化体系。其次,构建了针对野生型米曲霉宿主的根癌农杆菌介导转化方法。以米曲霉IFO4177为例探讨丝状真菌的转化方法,包括原生质体转化和根癌农杆菌介导的丝状真菌转化。由于米曲霉一直没有找到合适的抗性标记,因此转化后筛选工作困难,未得到稳定遗传的转化子。对转化方法进行改进后,本研究以泡盛曲霉CBS115.52为例,建立根癌农杆菌介导的泡盛曲霉转化方法,将米黑根毛霉脂肪酶基因转入其中,从DNA、RNA和蛋白水平对转化子进行了检测,筛选到稳定遗传的转化子并对其表达的脂肪酶酶活进行了初步测定。