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棉花是一种重要的工业原料、纺织原料以及战略物资。而棉花植株最重要的部分当属棉纤维。棉纤维细胞由胚珠外层珠被上表皮细胞分化而来,是一类独特的单细胞,其发育过程可分为纤维起始、初生壁形成、次生壁加厚和脱水成熟四个连续而重叠的时期。棉纤维细胞壁不仅决定了棉纤维细胞的形态发生,也决定着最终成熟纤维的品质,因此全面了解棉纤维细胞壁合成是非常重要的。木聚糖是一种重要的半纤维素,本实验室之前分离鉴定了多个可能参与木聚糖合成的糖基转移酶基因。其中一个命名为GhGT47A,它与参与拟南芥木聚糖还原末端的AtFRA8有最高的氨基酸序列同源性。此外,我们也分离鉴定了一个可能调控次生细胞壁合成的MYB转录因子基因,命名为GhMYB1G。本文对这两个基因进行了研究探讨,取得如下研究结果：1.GhGT47A对fra8突变体的回补实验为了解GhGT47A是否发挥与拟南芥FRA8类似的功能,构建了GhGT47A的过表达载体,转化fra8突变体。由于fra8纯合突变体植株矮小、叶片颜色暗绿且不育。我们选择fra8杂合突变体进行转化。经筛选得到表达GhGT47A转基因植株。RT-PCR结果显示fra8+GhGT47A回补株系中FRA8基因无表达且GhGT47A有表达,表型观察发现fra8+GhGT47A回补植株与fra8纯合突变体表型基本无差别,显示GhGT47A不能回补fra8突变体,可能发挥着与AtFRA8不同的功能。2.GhGT47A RNAi与过量表达GhGT47A转基因棉花的鉴定及表型分析为了解GhGT47A在棉纤维发育中的功能,构建了GhGT47A-RNAi载体,转化棉花,获得转基因棉花及其后代株系。对T2代GhGT47A RNAi转基因棉花植株进行阳性鉴定和表达分析,结果显示在开花后15天(15DPA)和20DPA纤维中,RNAi沉默导致GhGT47A表达量下调,转基因植株棉铃变小,但成熟纤维长绒长度减小,且种子体积变小。进一步分析发现,在转基因植株20DPA和成熟纤维细胞中纤维素及细胞形态无明显变化。构建了GhGT47A过量表达载体,转化棉花,获得过表达GhGT47A的转基因棉花植株。部分转基因棉花植株能够正常发育,开花结实,收获到T1代种子,并种植得到T2代转基因棉花株系。初步观察发现,转基因植株成熟纤维长度增加,且种子体积变小。3.GhMYB1G在棉花中的表达及蛋白自激活分析定量RT-PCR结果显示GhMYB1G主要在棉花下胚轴中高表达,在棉纤维次生壁加厚期(15和20DPA纤维)也有较高表达。构建了pGBKT7-GhMYB1G载体并转化酿酒酵母AH109与Y187。X-Gal显色反应及缺陷培养基筛选观察后发现GhMYB1G具有自激活功能,这可能表明GhMYB1G是转录因子。4.GhMYB1G启动子活性分析为进一步研究GhMYB1G的表达调控,分离了GhMYB1G启动子,构建了pBI101-GhMYB1G promoter表达载体,转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株。GUS组织化学分析显示GhMYB1G启动子可以驱动GUS基因在转基因拟南芥植株茎、主根、侧根以及叶中表达,角果以及花药组织也出现了GUS信号。这暗示GhMYB1G可能参与调控细胞壁合成。5. GhMYB1G可能负调控转基因拟南芥次生壁合成为研究GhMYB1G的功能,构建了pBI121-GhMYB1G过量表达载体,转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株。表型观察发现绝大多数转基因拟南芥呈现叶片上卷且颜色深绿,植株体形变小等表型。切片染色观察发现茎维管组织木质部细胞纤维素合成略微下降,而主根次生木质部部位纤维素、木质素合成减少。主根初生木质部部位木质素含量增加。qRT-PCR结果显示转基因拟南芥花序茎部位中纤维素及木质素合成基因表达下调,这说明GhMYB1G可能负调控细胞次生壁合成。然而在转基因拟南芥中木聚糖主链合成基因IRX9、IRX14表达量下调,但还原末端合成基因FRA8表达量上调,暗示了GhMYB1G在细胞壁木聚糖合成中可能具有特殊的调控作用。6. GhMYB1G可能参与调控GhGT47A的表达分析GhGT47A启动子序列发现其内部含有两个MYB结合元件,推测该基因可能受GhMYB1G的调控。为了探究GhMYBIG能否与MYB结合元件以及GhGT47A启动子结合,EMSA实验和酵母单杂交实验正在进行中。构建了His-GhMYB1G融合蛋白表达载体,并进行小量纯化和WESTERN BLOTTING检测,证明目的蛋白已被纯化出来。同时将GhGT47A启动子截断为前后两个lkb片段,分别构建到pAbAi载体中并转化酿酒酵母Y1HGold。挑去阳性菌落进行抑制实验,发现均可被400ng/ml的ABA抑制。