大豆因其较高的油脂含量和优质蛋白质被广泛种植,制作成饲料及各类副产品。但是大豆也是联合国粮农组织认定的八大过敏原之一,极大的影响着敏感人群的生命健康。因此深入探究大豆蛋白的致敏机理,精确定位出致敏位点可以为低致敏性产品的研发提供依据,同时研究降低大豆致敏性的加工方法,对于大豆过敏患者具有深远意义。本文以大豆球蛋白G1亚基A1a酸性多肽链（以下称为G1A1a）为研究对象,通过数据库索引获得氨基酸序列,以G1A1a的同源蛋白质为依据建立其三维结构模型,并对该模型的线性表位和构象表位进行预测,结合亲水性、表面可及性和抗原性等性质预测出了10个线性表位和部分构象表位。10个可能性较高的线性表位为:24EQPQ QN29、40KPDNRI45、56NPNNK60、80RRPSYTNG87、114PQQPQQRGQS123、197QEQGG HQSQKGKHQQEEENE216、247NEGED251、267PPTDEQQQRP276、285DEKPQCKGK293、299RPRGS303。预测结果分析:β-折叠和无规则卷曲位置有较大的可能性成为抗原表位。结合预测表位,采用重叠分段（overlapping）的方法将G1A1a的氨基酸序列分为A1a-1、A1a-2和A1a-3三段,并设计每条分段的引物。将PCR扩增后的G1A1a基因和重叠片段基因进行胶回收,回收片段与T载体连接构建成克隆载体,转化后挑选阳性菌扩大培养提取质粒,质粒双酶切后与T7噬菌体臂连接,将连接后的载体经过体外包装侵染大肠杆菌,使得目的基因能够正常表达。富集纯化表达的噬菌体蛋白,为后续免疫学检测实验做准备。将足量的热加工处理大豆球蛋白与兔源大豆球蛋白多克隆抗体混合吸收,制备热加工蛋白的特异性抗体。特异性抗体与噬菌体表达蛋白进行ELISA反应,定位出热加工破坏的优势抗原表位位于片段A1a-2上。将片段A1a-2进行重叠分段,分为A1a-2-A、A1a-2-B、A1a-2-C三段,对重叠分段再次进行PCR扩增,克隆载体、表达载体的构建,得到噬菌体表达蛋白,免疫反应结果显示片段A1a-2-B含有热加工破坏抗原优势表位。为进一步缩小热加工破坏抗原优势表位所在区域,进行最终一轮的重叠分段,将片段A1a-2-B分为片段A1a-2-B-Ⅰ、A1a-2-B-Ⅱ、A1a-2-B-Ⅲ。结果显示热加工破坏抗原优势表位位于片段A1a-2-B-Ⅰ,该片段氨基酸序列为SLENQLDQMPRRFYLAGNQEQEFLKYQQEQG。将三次overlapping分段筛选出的优势抗原表位与大豆过敏患者Ig E抗体进行ELISA反应鉴定致敏性,结果显示:三段抗原优势表位噬菌体表达蛋白均与大豆过敏患者Ig E抗体产生阳性反应,即确定片段A1a-2-B-Ⅰ为G1A1a的优势致敏表位区域。通过在线软件分析,显示该片段含有51.61%的无规则卷曲,其结构分布符合表位预测时所得出的结论。对确定出的热加工破坏致敏优势表位区域进行精确定位:将片段A1a-2-B-Ⅰ分为重叠的三段进行多肽合成,经过斑点印记（Dot-blot）实验,结果表明只有肽2能够与兔源大豆球蛋白多克隆抗体呈阳性反应,即证明肽2中含有对应的线性表位,肽1与肽3中不含有相关线性表位,ELISA反应结果同Dot-blot实验结果一致。而热加工破坏的特异性抗体与三条多肽均不反应,则表明热加工处理对多肽中的线性表位没有产生破坏。而片段A1a-2-B-Ⅰ噬菌体表达蛋白能与热加工破坏特异性抗体结合反应,则证明片段A1a-2-B-Ⅰ中含有热加工破坏的构象表位。将合成多肽与大豆过敏患者Ig E抗体反应结果显示只有肽2呈阳性,表明肽2具有致敏表位。将肽2中的氨基酸逐个使用丙氨酸进行替换合成突变多肽,氨基酸突变后的多肽与BSA偶联,经过Dot-blot和ELISA实验,结果显示D157、Q158、M159、Y164是影响大豆球蛋白G1A1a抗原性的关键氨基酸。而Q158、M159、R162、N168是影响大豆球蛋白G1A1a致敏性的关键氨基酸。