脱氧核糖核酸(DNA)检验技术通过对犯罪现场遗留的血迹、精斑、唾液斑、毛发等物证的检验来认定和排除嫌疑人,在办案中发挥着重要作用。检验流程通常包括：检材提取,DNA提取定量,聚合酶连反应(PCR)复合扩增,毛细管电泳获取短串联重复序列(STR)分型,整个过程大致需要10-12个小时。如果缩短操作时间,简化步骤,不仅能减少工作量,还能提高检验速度,从而满足案件侦查和诉讼对于时效性的要求。生物物证经过前处理获得DNA之后,需要通过多位点复合扩增,获得常染色体或Y染色体STR分型,这是法医DNA检验中的常规方法。PCR是最常用的分子生物学技术之一,通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的扩增。普通PCR扩增过程一般需要3个小时,这是物证检验的限速过程,如果能将此过程缩短,将会显著提高物证检验速度。快速PCR是基于普通PCR的工作原理,在保证PCR特异性、灵敏性和保真度的前提下,在更短时间内完成对核酸分子的扩增。近年来,快速PCR主要从三个方面进行了研发：聚合酶的改进、添加剂的研发以及热循环仪的革新创造。快速聚合酶是通过基因工程手段获得的具有高延伸活性和速率的耐热DNA聚合酶,目前商品化的快速聚合酶有Takara公司的SpeedSTARTM HS、Fermentas公司的PyroStartTM Fast PCR Master Mix、Kappa公司的KAPA2G Fast PCR Kits等,不同聚合酶的保真度、特异性等都有差别。快速扩增仪是通过快速传热设计模式或增加热传导速率,使仪器的升/降温速率提高到6-15℃/s。如德国Analytik Jena公司的SpeedCycler2、Eppendorf公司的Mastercycler pro等。快速扩增技术已被用于病原体检测、疾病诊断等领域,但针对法医学的应用研究还很少。在建立快速PCR体系的过程中,首先确保体系特异性、准确性、灵敏度等重要参数不受影响,然后才是提高扩增速率。微量接触类物证是目前检案中的疑难物证,也是目前法医遗传领域的研究热点和难点之一。微量接触类物证是通过皮肤或粘膜接触而形成的一种物证,如刀柄、钥匙、手机、衣帽鞋袜、手套、门把手、果核、牙刷、饮料罐等客体上可能遗留有皮肤表皮脱落细胞或粘膜上皮细胞,此类潜在的生物物证,检验结果可能成为案件侦破的关键。此类物证由于检验成功率低,需要反复检验而成为案件检验的限速步骤。伴随犯罪智能化水平的提高,血迹、毛发、精斑等明显的物证常被有意识的破坏,而微量接触类物证由于量少不易被识别往往被忽略。自从1997年van Oorschot等首次报道接触DNA以来,此类物证越来越受到关注,检验量也不断增多,以公安部物证鉴定中心为例,近两年每年检验四万余份DNA检材,其中约40%为微量接触类物证。此类物证由于只有少量脱落细胞或DNA,肉眼很难判断样本具体部位盲目剪取,有时并没有取到样本靶细胞,剪取检材过大又会降低DNA的浓度,或引入外来污染,所以检出率低。国内在“十一五”期间,虽然研制了脱落细胞收集、提取等装置,但是针对此类物证仍缺乏系统的基础理论研究。实际上,渗透性、非渗透性等不同载体表面接触DNA的含量、保存时间、DNA二次转移发生率、适用的提取方法等都有很大差别,相关问题的系统研究和基础数据的积累可以有效避免盲目提取和重复检验,并且对于确定检材的检验顺序、提取部位、提取方法等快速处置和检验策略有重要指导意义。从犯罪现场收集生物物证时通常称为一次转移,在物证从犯罪现场送至实验室进行检测之前,这些物证通常保存在公安机构指定的物证袋中,在此过程中,物证与物证袋之间相互接触,罗卡定律指出“凡两个物体接触,必会产生转移现象”,因此物证会转移到物证袋,产生二次转移或多次转移。近年来,关于DNA来源于游离DNA或细胞内DNA的问题也成为了此类物证的一个重要研究方向。所以本课题拟在前期基础上,针对微量接触类生物物证,以手部接触类物证为研究对象,研究不同载体上DNA的检出量和检验效果、前处理方法、检验时效、DNA二次转移和转移率、游离DNA的存在及与细胞内DNA比例等相关问题。根据快速聚合酶、热循环仪、AmpFLSTR(?) Identifiler(?) Plus试剂盒引物和公安部物证鉴定中心研发的19个位点的引物进行筛选和优化,建立适合法医常用的快速扩增技术。从物证的快速处置和扩增两方面入手,通过系统探究生物物证中的DNA含量、保存时间、来源、二次转移等基础理论数据问题和快速PCR相关研究,建立适合微量接触类生物物证的快速检验技术。针对微量接触类检材的相关研究：制备检材,分别用直接剪取法、胶带粘取法、两步擦拭法和真空吸取法对检材进行前处理,然后进行DNA提取,筛选最佳前处理方法,用最佳前处理方法处理放置不同时间段的检材,时间段为一年(2、6、10、30、60、90、180和360天)之内,观察此类检材检验效力的变化。针对二次转移实验制备检材,使用塑料物证袋和纸质物证袋提取物证,模拟物证运输过程,分别使用常规程序对物证袋和物证进行DNA提取、定量和扩增,并对各项结果进行分析和讨论,观察物证袋的转移效力。针对游离DNA实验,制备检材,对游离DNA和细胞内分别进行定量和STR扩增,并对结果进行分析和讨论,观察游离DNA和细胞内DNA的比例,及游离DNA对此类检材检验结果的影响。实验过程中,实验室温度保持22-24℃,空气相对湿度为50%。DNA提取方法为磁珠法,具体操作参照M48 QIAGEN(?)试剂盒使用说明。用7500Real-Time PCR systems和QuantifierTM Human DNA quantification kit对DNA进行定量,AmpFLSTR(?)Identifiler(?) Plus试剂盒进行扩增,ABI3130XL型遗传分析仪进行电泳,GeneMapper ID V3.3软件分析数据。每组均设置空白试剂阴性对照和9947阳性对照。结果以质量的形式呈现,以各等位基因峰高大于50RFUs者为有效分型结果。平均等位基因数=有效分型结果总数/样本数。检测率=检测到的样本数/样本总数。用Student’s t test、One-Way ANOVA、 Mann-Whitney U-test和Kruskal-Wallis one-way analysis of variance进行统计学运算。实验观察到总体上使用直接剪取法进行前处理的检材提取到的DNA量大于使用两步擦拭法和真空吸取法进行前处理提取到的DNA量,且四种前处理方法在针对不同载体的检材上有差异；随着时间推移,放置360天内的DNA检出量和检验效果无明显变化。二次转移实验观察到100%的检材发生DNA转移,其DNA转移率平均为22.06%,纸质物证袋和塑料物证袋的平均转移率分别为为26.27%和17.85%,所有样本在纸质和塑料物证袋中的转移率有差别(p=0.023),纸质物证袋的转移率较高。接触类样本与非接触类样本的转移率有差别(p=3.14E-49),接触类样本的转移率较高。游离DNA的实验观察到,75.6%的样品检测到了游离DNA,其中,手部、面部、足部检材和口腔试子的游离DNA检测率分别为82.1%、82.1%、53.6%和96.4%,微量接触类检材中游离DNA量占DNA总量的12.9%。针对快速PCR的相关研究：分别研究了七种快速酶、常用的STR扩增试剂盒和两台热循环仪,从缩短扩增时间和提高扩增效力的角度出发进行调整、比较和优化,优选出扩增时间最短和扩增效力最好的酶。应用此酶优化好的扩增体系和程序进行一系列验证评价。研究构建了一个关于TAKARA SpeedSTAR酶和AmpFLSTR(?) Identifiler(?) Plus试剂盒中的引物的10μL扩增体系和程序,此程序在热循环仪上耗时仅为25min。同时构建一个关于含有19个位点的混合引物和Roche FastStart酶的10μL扩增体系和程序,此程序在普通热循环仪上耗时仅为69min。,经验证,两个体系和程序均可应用于血液、口腔拭子、脱落细胞、精斑、骨骼及牙齿等常规检材,灵敏度均为0.25 ng,准确性均为100%。结论：微量接触类检材的相关研究明确了渗透性载体的DNA检测量高于非渗透性载体的DNA检测量,不同的前处理方法在针对不同载体时存在差异,检材常温干燥放置一年内,其DNA无明显降解。在物证的提取过程中,DNA会转移到物证袋造成潜在的DNA丢失,纸质物证袋的转移率较高,微量接触类检材的转移率高于其他检材。接触类检材中提取到的DNA,除了细胞内DNA,还存在一定比例的游离DNA,且会影响检材最终的分型结果。近年来,此类检材占据了案件中的主要部分,本实验的研究结果将有助于指导针对此类检材的检验,为其快速检验提供新途径,为存放不同时间后检材检验的必要性提供数据证明,为公安机构和科研院所提供可靠的数据支持和理论依据,提高此类检材的物证证明力,为案件侦破和科研研究提供有力支持。在实际案件中,尤其目前此类检材是最常见的检材之一,即使微量DNA的丢失也可能会造成最终DNA无分型或者分型缺失,这些丢失的DNA可能成为案件侦破的关键。本实验所涉及的检材均为干燥性检材,排除了湿性的影响,为犯罪现场干燥性检材的提取、存储和运输提供了新的见解和帮助。随着进一步研究检材的不同特性,干燥性和湿性检材以及不同环境对二次转移的影响等将有望对物证的存储、提取和运输提供更为便利和合适的方法。游离DNA的发现以及与细胞内DNA量的比例为案件中此类检材的有效发现、提取和检验提供了重要论点和依据,为相关技术和装置研究提供了重要科学基础。从缩短扩增时间和调整扩增体系和程序出发,快速扩增检验研究系统优化了七种快速酶和两组引物,建立了两组在缩短扩增时间上很有优势的扩增体系和程序,为整个DNA检验过程缩短了时间,提高了法医检验的效率,满足了案件侦查和诉讼对于时效性要求,提升了生物物证的证据价值和证明力,为公安机关进行PCR扩增提供了便利,满足了科研院所对快速扩增检验的要求,通过系统研究、筛选、构建和优化适合于法医常规检材的扩增体系和程序,为更进一步的快速酶和热循环仪的改进奠定了基础。总体上,本研究针对微量接触类生物检材的快速处置策略做了系统研究,其实验结果最终形成了适合此类物证的快速处置和检验策略,从而提高了法医检验的效率,提升了生物物证的证据价值和证明力。