Rho激酶(ROCK1和ROCK2)属于AGC家族的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它是第一个被发现的Rho蛋白下游效应因子,其通过磷酸化下游的效应蛋白(MLC、Lin-11、Isl-1、LIMK、ERM、MARCKS、CRMP-2等)来实现其生物学功能。大量的研究证明,ROCKs参与了多种疾病的发生和发展,如心血管疾病、神经系统疾病和癌症等,因此ROCKs被认为是一类重要的药物研发的靶点。尽管大量的ROCKs小分子抑制剂已经被报道,但大都不是理想的先导化合物,目前仅有法舒地尔在日本被批准上市用于治疗脑血管痉挛和缺血。因此,研发和设计新颖的、药效强的以及副作用小的ROCKs抑制剂具有非常重要的意义。本论文首先采用分子对接的方法对ChemBridge和Specs化合物数据库中的化合物进行筛选。接着,挑选并购买了174个化合物进行ROCK1激酶活性实验和细胞活性实验,其中12个类药性化合物显示出微摩范围的抑制活性(IC50值在7μM到28μM之间),并且在体外具有明显的抑制肺癌细胞、乳腺癌细胞和骨髓瘤细胞增值的活性;最后结构分析的结果显示2个化合物(化合物13和24)具有新颖的结构。此外,药理学实验的结果发现化合物24在斑马鱼体内能够有效地预防及治疗阿托伐他汀引起的脑出血,可以作为治疗脑出血疾病的潜在候选先导化合物。在第三和第四章中,采用分子对接、分子动力学模拟、MM/GBSA结合自由能计算和自由能分解的方法,从原子水平研究了ROCK1与三嗪类抑制剂以及LIMK2与吡咯并嘧啶类抑制剂的结合模式,研究了蛋白受体在与抑制剂结合过程中构象的动态变化,并分析了受体重要氨基酸残基及抑制剂的不同取代基对抑制剂结合的作用。根据理论预测的结果,我们设计了一系列新颖的抑制剂,并且对设计抑制剂进行理论的验证,发现这些抑制剂表现出较强的结合亲和力,可能具有更优的活性。在第五章中,我们对虚拟筛选得到的ROCK抑制剂FPND的预防脑出血机制进行了深入的药效学和药理学研究。FPND具有新颖的骨架结构并且在微摩尔的浓度下具有明显的抑制活性。首先我们采用分子动力学模拟、MM/GBSA结合自由能计算和自由能分解方法对FPND对ROCK1和ROCK2的选择性抑制的根源进行了探讨;结果发现FPND与ROCK1和ROCK2之间的结合亲和力的差异主要是由非极性能量项贡献的。在斑马鱼模型中,我们发现该化合物对阿托伐他汀诱导的脑出血具有明显的保护作用以及显著防止内皮细胞破裂的作用;最后,xCELLigence RTCA系统分析,免疫荧光和Western印迹分析的结果表明这种预防及保护的作用是通过抑制ROCK/MYPT1/MLC2、ROCK/LIMK/丝切蛋白和Src/VEC信号通路来完成的。总而言之,FPND是一个低毒安全的,并能有效的预防脑出血的候选先导化合物。在最后一章中,我们采用并行虚拟筛选以及相似性搜索的筛选策略对Chembridge化合物进行了虚拟筛选,并结合子结构匹配方法获得及挑选了79个可能的ROCK1小分子抑制剂。激酶抑制实验证明其中有21个化合物对ROCK1具有明显的抑制活性,其中有4个化合物的IC50值低于0.5μM。此外,我们发现在这些抑制剂中有17个化合物具有新颖的母核结构—吡咯并吡啶基,分子模拟结果证明该母核结构对抑制剂的活性是不可或缺的。此外,实验还证明了化合物TS-15和TS-40在细胞中能够通过抑制ROCK的活性来抑制ROCK下游效应蛋白丝切蛋白的磷酸化程度,并且它们在斑马鱼体内具有预防和治疗斑马鱼脑出血的效果。总而言之,并行虚拟为药物设计提供了一个新的策略。