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研究目的沉默信息调节因子相关酶3(sirtuin3, sirt3)为沉默信息调节因子2(silent information regulator2, SIR2)家族成员之一,定位于线粒体内膜,具有脱乙酰基酶活性。人们发现这个蛋白参与调控了许多细胞进程,如细胞代谢、细胞周期、细胞凋亡、细胞分化及细胞寿命等。Sirt3增加表达与延长人类的寿命有关。近年来,越来越多的研究集中在它与心血管疾病的关系上。目前,对于sirt3与高血压所致左心室肥厚的关系尚不明确。本研究旨在观察sirt3在自发性高血压大鼠(SHR)心肌中的表达,并探讨sirt3在高血压所致左心室肥厚(left ventricular hypertrophy, LVH)中的作用。方法1.实验动物和设计选择29周龄自发性高血压大鼠(SHR)26只,随机分为SHR30周组(喂养1周)和SHR38周组(喂养9周)；另选同龄Wistar—Kyoto (WKY)大鼠20只,随机分为WKY30周组(喂养1周)和WKY38周(喂养9周)作为正常对照。分批于30周及38周处死。各组测定尾动脉收缩压和左心室质量/体质量(LVM/体质量)。留取心尖(约1/2左心室)的部分,锡铂纸包裹后液氮冷冻,-80℃冰箱保存已备做qRT-PCR及Western用。余1/2左心室组织经过4%多聚甲醛固定48小时后,进行石蜡包埋以备用于免疫组织化学染色。2.超声心动图测量PHILIPS公司IE33心脏超声仪,选S12-5超声探头,频率约5MHz,测量左室舒张末期内径(LVEDd),左室收缩末期内径(LVESd),舒张末期左室后壁厚度(LVPWD),舒张末期室间隔厚度(IVSD),左室短轴缩短率(LVFS)以评价心脏的结构和功能。3.Masson染色切片常规脱蜡至水,Masson三色染色试剂盒进行染色,梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。并采用全自动图像分析系统,在光镜下随机选取5个视野,测量心肌组织胶原容积积分(CVF)。CVF=胶原面积/总面积(其中胶原面积不包括血管周围胶原面积)。4.免疫组织化学染色取组织切片,进行sirt3的免疫组织化学染色,每只实验动物选取5张切片,随机分析3个视野,图像采用Image-Pro Express6.0软件分析蛋白表达量,结果以累积光密度值表示。5. Western blot法显示组织中蛋白的表达将-80℃保存的组织,先进行总蛋白的提取,然后用BCA法测定蛋白的浓度,再按常规方法配分离胶和浓缩胶,电泳、转膜、封闭、一抗过夜、二抗孵育、曝光、显影、定影,条带用Image-Pro Express6.0软件分析灰度值。6.实时定量多聚酶链反应(qRT-PCR)Trizol法提取总的RNA,然后逆转录mRNA至cDNA,用Premer5.0设计sirt3的特异引物,以GAPDH基因做内参照,荧光定量PCR检测sirt3的mRNA的相对表达。7.统计学处理数据用SPSS17.0统计软件分析,计量资料以均值±标准差(x±s)表示,多个样本均数比较采用单因素的方差分析,两两比较采用SNK检验,直线相关(Person相关)分析用以研究两变量之间的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.实验中2只SHR大鼠死亡,均为SHR38周组,最终44只完成实验。其中SHR30周组11只,SHR38周组13只,对照组WKY大鼠20只。2.与WKY对照组大鼠比较,SHR组的收缩压、LVM/体质量、左室收缩末期内径、舒张末期室间隔厚度、舒张末期左室后壁厚度、CVF、sirt3mRNA和蛋白表达均明显升高(均P<0.05)；左室短轴缩短率、左室舒张末期内径均明显降低(均P<0.05),SHR大鼠表现出明显的左心室肥厚,左心室收缩及舒张功能明显减低,随着周龄的延长,心肌肥厚及心功能障碍明显加重(均P<0.05)。3.把SHR心肌sirt3mRNA表达与左心室肥厚指标进行相关性分析,可以证实在SHR大鼠,左心室肥厚与心肌sirt3基因存在着显著的相关关系。结论1.心肌组织高表达sirt3与左心室肥厚密切相关。2.在SHR大鼠,随着周龄的延长,心肌肥厚的加重,sirt3的表达进一步增加。