番石榴叶多糖活性分析及分离鉴定与发酵提升

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番石榴叶为姚金娘科植物番石榴的叶。番石榴叶常用于治疗腹泻、积食腹胀、牙龈肿痛、湿疹和糖尿病等。本论文研究了番石榴叶多糖的提取、分离纯化、结构特征和消化特性;通过体外实验结合动物实验评估了番石榴叶多糖的抗氧化和降血糖活性;最后,通过固态发酵技术提升番石榴叶多糖的产量和生物活性。主要研究结果如下:(1)超声辅助提取法可以高效提取番石榴叶多糖,在响应面优化条件下(超声功率404 W,提取温度62℃,超声时间20 min),番石榴叶多糖的得率为1.00±0.04%,提高了约1.5倍,与预测值0.96%接近;多糖的糖含量为64.42%,糖醛酸含量为9.13%,不含蛋白。(2)体外抗氧化活性实验表明番石榴叶多糖具有较强的清除DPPH自由基、ABTS自由基和OH自由基能力,其半数清除浓度值(IC50)分别为46.49μg/m L,102.82μg/m L和175.52μg/m L;体外降血糖实验结果显示番石榴叶多糖具有潜在的降血糖作用,番石榴叶多糖对α-葡萄糖苷酶有很强的抑制作用且呈剂量依赖性(IC50=16.28μg/m L),但对α-淀粉酶的抑制作用较弱(IC50=49.13 mg/m L)。(3)高脂饲料喂养结合腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型,用50 mg/kg和100 mg/kg番石榴叶多糖灌胃4周,发现番石榴叶多糖能有效改善糖尿病小鼠的症状,主要表现在:(a)显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖值,提高糖耐量和控制体重丢失;(b)显著降低糖尿病小鼠血清甘油三酯、总胆固醇、糖化血清蛋白、肌酐水平;(c)显著提升糖尿病小鼠血清总抗氧化能力,增强肝脏中超氧化物歧化酶活和谷胱甘肽过氧化物酶活,降低丙二醛含量;(d)对糖尿病小鼠的肝脏、肾脏和胰腺组织有积极的保护作用。(4)采用葡聚糖凝胶G-200柱层析法从番石榴叶粗多糖中分离得到一种新的杂多糖GLP-1,糖含量为89.69%,平均分子量为812.83 k Da,主要由葡萄糖(59.37%)、阿拉伯糖(14.49%)、半乳糖(14.25%)、半乳糖醛酸(4.58%)、鼠李糖(4.19%)、甘露糖(1.73%)和葡萄糖醛酸(1.39%)组成。糖苷键类型包括(1→4)和(1→6)链接的葡萄糖,(1→6)链接的半乳糖,(1→3)链接的鼠李糖,(1→5)链接的阿拉伯糖,(1→3,6)链接的甘露糖以及(1→)链接的葡萄糖末端。GLP-1结构复杂,可能具有三股螺旋结构。GLP-1具有较强的清除自由基能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性。(5)模拟人体胃-肠道消化实验显示GLP-1在胃液中呈现絮凝状态,胃消化液对GLP-1有一定的降解作用,平均分子量由812.44 k Da降低至802.83 k Da。GLP-1在小肠液中复溶,平均分子量略微下降。消化液中还原糖含量增加,但是在胃肠消化液中均未检测到游离单糖,说明GLP-1在胃肠道消化过程中分子量降低是由分子链间糖苷键断裂引起的。经胃肠道消化后,番石榴叶多糖GLP-1仍具有一定的抗氧化能力(IC50=904.89μg/m L)和较强的抑制α-葡萄糖苷酶能力(IC50=37.89μg/m L)。(6)巨大芽孢杆菌和红曲霉发酵番石榴叶均能显著提高多糖的得率,增加糖醛酸和结合蛋白含量,以及增强多糖的抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性。固态发酵过程中,多糖的产量和生物活性呈动态变化,存在最佳发酵拐点,发酵后多糖分子量下降。巨大芽孢杆菌发酵番石榴叶,发酵3天的番石榴叶多糖得率最高为3.53%,是未发酵番石榴叶的1.30倍,其抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶活性最佳;主要多糖组分的平均分子量从697.61 k Da下降至633.28 k Da。红曲霉发酵番石榴叶,发酵7天的番石榴叶多糖得率最高为2.54%,其抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶活性最佳,主要多糖组分的平均分子量从893.88 k Da下降至672.76 k Da。微生物发酵过程中分泌的纤维素酶与番石榴叶多糖释放、高分子量多糖降解和低分子量多糖的生成密切相关。番石榴叶多糖可开发成功能性食品或辅助降血糖药物。固态发酵技术可以应用于多糖生产、提取和改性等方面。
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