癫痫是一种以发作为主要临床表现的神经功能障碍综合症，研究推测世界3-5%的人都有患癫痫的风险。尽管癫痫治疗已从传统的药物控制、手术治疗发展到迷走神经刺激、深部脑刺激等，但是目前的抗癫痫手段仍然存在不少缺陷，因此有必要探索新的抗癫痫策略。研究表明移植的干细胞在癫痫模型中可释放内源性抗癫痫物质、替代损伤神经元或分泌疾病修饰因子，因此干细胞有望成为新的抗癫痫手段。同时大量证据显示干细胞衍生的伽马氨基丁酸(gamma-amino butyric acid, GABA)能神经元对皮质和海马兴奋性具有重要的调节作用，中枢神经系统GABA能神经元的缺失或损伤将导致各种不同程度的癫痫，鉴于GABA能系统的重要性，各种不同源性（神经干细胞或胚胎干细胞）的GABA能神经元已尝试用于治疗癫痫并取得一些积极成效，但这些干细胞的应用研究由于伦理障碍和来源匮乏颇受限制。骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)作为骨髓来源的干细胞，不仅来源丰富，还易于分离纯化、不涉及免疫排斥、具有多向分化潜能等特点，因此方便应用于基础研究和应用探索。目前研究显示BMSCs移植对部分神经功能缺失、创伤性脑或脊髓损伤、自体免疫缺陷性疾病等具有明显治疗效果，最近研究发现BMSCs移植不仅能抑制癫痫模型的自发作性再发作(spontaneous recurrent seizure,SRS)次数和癫痫波频率，还能改善癫痫模型的认知和记忆功能。但是，迄今为止尚未有文献报道通过促进移植的BMSCs向GABA能神经元转化，进而提高BMSCs对癫痫的治疗效果。尽管研究证实BMSCs经条件诱导可向GABA能神经元分化，但是目前诱导方案涉及贝塔巯基乙醇(beta-mercaptoethanol, BME)、维甲酸(retinoic acid,RA)、氯化钾(potassium chloride, KCl)等多种诱导因素，体内应用不太实际。大量研究表明下调干细胞抑制型碱性螺旋-环-螺旋(basic helix loop helix, bHLH)基因(如发状分裂相关增强子(hairy and enhancer of split, Hes))表达将不能充分增殖而提前向终末神经元分化，特别是Hes1的表达与活性对于干细胞向GABA能神经元分化具有重要影响，BMSCs向神经细胞分化同样与Hes1的表达相关。因此推测，沉默BMSCs中的Hes1基因表达将促其向GABA能神经元分化。本论文首先通过RNAi技术沉默BMSCs中的Hes1基因，继而依托条件诱导验证其是否促进BMSCs向GABA能神经元分化，最后通过对大鼠癫痫模型移植Hes1基因沉默的BMSCs (Hes1gene silencingBMSCs，H-BMSCs)分析其是否进一步促进癫痫模型的功能恢复和神经再生。第一部分Hes1基因沉默促进BMSCs向GABA能神经元分化目的：探索Hes1基因沉默对BMSCs向GABA能神经元分化的影响。方法：体外分离纯化2-3周(week, w)的SD大鼠BMSCs，依赖表面抗原的相应抗体和多向分化潜能鉴定BMSCs，通过RNAi技术抑制BMSCs表达Hes1基因，而后通过条件培养基(1μmol RA、1mmol N5,O2’-二丁酰腺苷3’:5’-环磷酸(N5，O2’-dibutyryladenosine3’:5’-cyclic phosphate, Bt2cAMP)、2%B27)分别诱导BMSCs (对照组)和H-BMSCs(实验组)，最后通过免疫细胞化学和免疫印迹试验(western blot, WB)分析BMSCs和H-BMSCs的分化趋向。结果：免疫细胞化学结果显示BMSCs高表达CD105(98.00±0.89)%、CD73(95.68±1.55)%和CD90(95.38±1.27)%,几乎不表达CD34(1.62±0.44)%, CD11b (0.41±0.47)%，流式细胞术结果提示BMSCs CD105、CD73和CD90的表达量分别为99.6%、91.8%和91.4%，CD11b和CD34分别表达2.1%和0.6%，BMSCs条件诱导可成骨、成软骨、成脂肪分化。BMSCs经Hes1siRNA干涉后，WB测试结果显示转染后的BMSCs基本不表达Hes1，提示BMSCs中的Hes1基因被抑制。实验组和对照组细胞经条件培养基诱导分化3-7d，免疫细胞化学结果显示：实验组分化后细胞表达GAD67(32.8±2.2)%、NeuN (67.4±3.3)%、NF-H (71.9±4.6)%和Nestin(19.4±1.8)%，对照组分化后细胞GAD67、NeuN、NF-H和Nestin的阳性细胞数分别为(22.4±4.4)%、(63.1±6.0)%、(67.1±6.3)%和(30.5±2.2)%；WB结果显示当Hes1抑制后，通过Bandscan灰度分析软件分析发现H-BMSCs分化细胞的GAD67或NeuN蛋白灰度值与β-actin的比值明显高于对照组。结论：抑制BMSCs表达Hes1基因可促其向GABA能神经元分化。第二部分Hes1基因沉默的骨髓间充质干细胞对癫痫模型的治疗作用目的：研究H-BMSCs移植对癫痫模型的治疗作用。方法：体外用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyUridine, BrdU)和超小型超顺磁氧化铁粒子(ultrasmallsuperparamagntic iron oxide, USPIO)双重标记H-BMSCs和BMSCs，氯化锂-匹罗卡品造模成功后移植生理盐水(对照组)、BMSCs (实验组Ⅰ)和H-BMSCs (实验组Ⅱ)，移植后3天(day, d)、7d、14d、21d和28d分别观察实验组和对照组的死亡率、SRS频率和神经缺损评分(neurological severity score, NSS)，并在相应时间点检查不同组别的脑电图(electroencephalography, EEG)，最后通过组织学试验(免疫组织化学和尼氏染色)分析各组组织切片的区别。结果：移植细胞活体示踪和3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine, DAB)染色定位发现H-BMSCs和BMSCs随着时间推移可向海马、齿状回及海马旁皮质迁移，并在细胞移植后的第14d达到峰值；细胞移植后一周内对照组、实验组Ⅰ和实验组Ⅱ的死亡率分别为41.7%、38.5%和21.4%，一周后均未见癫痫模型再死亡；关于SRS频率，细胞移植后的第7d到28d，对照组为0.27±0.25，实验组Ⅰ为0.14±0.20，实验组Ⅱ为0.09±0.14；NSS评分结果显示，实验组Ⅱ较对照组和实验组Ⅰ在不同时间点的评分明显低；EEG结果显示细胞移植后实验组Ⅱ的棘波或棘慢波频率较实验组Ⅰ和对照组明显降低，特别是在细胞移植后的第14d尤为明显；免疫组化结果示在海马旁皮质，实验组Ⅱ可见较多的谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase, GAD)67阳性细胞、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)阳性细胞及少量神经胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein, GFAP)与BrdU共定位，实验组Ⅰ自始自终只有很少的GAD67阳性细胞或NSE阳性细胞与BrdU共存，在海马及齿状回，实验组和对照组均未发现BrdU阳性细胞与GAD67阳性细胞、NSE阳性细胞或GFAP阳性细胞共定位；尼氏染色结果示实验组Ⅰ和实验组Ⅱ海马区神经元密度较对照组明显增加(P＜0.01)，但是实验组Ⅰ与实验组Ⅱ之间的比较无明显统计学意义(P=0.137978698,＞0.05)，而在海马旁皮质，实验组Ⅱ在不同时间点的神经元密度均高于实验组Ⅰ和对照组。结论：移植H-BMSCs较BMSCs更有利于癫痫模型的功能恢复和神经元再生。