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【目的】
利用液相色谱串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)联用和靶向代谢组技术,研究健康志愿者(Health组)和缺血性脑卒中(Ischemic stroke, IS)患者血浆中158种类二十烷酸的含量差异。通过多维统计分析结合机器学习的方法筛选可用于辅助诊断缺血性脑卒中的类二十烷酸脂质生物标志物。同时,采用酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)技术检测候选标志物代谢相关蛋白的表达水平,探讨缺血性脑卒中中类二十烷酸水平变化的可能机理。
【方法】
第一部分,设定严格的标准采集了122例健康志愿者和197例缺血性脑卒中患者(包含155例首发缺血性脑卒中患者(First-everischemicstroke,FS)、42例复发性缺血性脑卒中患者(Recurrentstroke,RS))的血液作为实验研究对象。血液样本用含肝素的抗凝管收集,分离血浆后置-80℃冰箱保存。使用固相萃取(Solid phase extraction, SPE)方法对血浆样本中的类二十烷酸脂质代谢物进行提取纯化。以16种同位素标准品作内标,将158个待测组分为16个组,每组用一个同位素内标作为标准,建立了158种脂肪酸代谢物的LC-MS/MS分析方法,用于血浆样品中类二十烷酸的含量分析。采集到的原始数据使用EXCEL进行预处理并标准化,再使用SIMCA-P13.0代谢组学软件中的正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal Partial Least Square-Discriminant Analysis, OPLS-DA)法对该数据集进行处理,用以反映是否存在类二十烷酸差异组分可以区分健康与缺血性脑卒中。使用SPSS对该标准化数据集进行t检验,P<0.05则认为相关组分在两组间具有统计学差异,得以初步筛选出差异组分。然后,将该含候选差异化合物的数据集随机分配为训练集(75%)和验证集(25%),其中训练集衍生疾病风险算法,验证集应用算法并进行测试。使用逐步变量选择和向后消除的逻辑回归模型可最佳区分训练组:Health组与IS组(包含FS和RS),以及FS组与RS组。我们推导了随机森林机器学习算法,以研究候选标记物作为缺血性脑卒中预测的准确性、敏感性和特异性。对于机器学习算法,通过对训练集使用10倍交叉验证来确定判别分析物,以确保其能达到最佳性能。然后,结合接受者操作特性曲线(Receiver operating characteristic curve, ROC)的曲线下面积(Area under the curve, AUC)筛选类二十烷酸特征代谢物。随后,根据该特征代谢物的含量变化,结合脂肪酸的代谢途径对它们进行生物功能分析,并探讨类二十烷酸在缺血性脑卒中发生过程的可能机制。
第二部分,在第一部分的血浆样本中随机选取40例首发缺血性脑卒中患者、40例健康志愿者的血浆作为第二部分的研究对象。采用ELISA技术对前面研究发现的类二十烷酸代谢差异组分的代谢相关蛋白进行分析,探讨其参与调控的机理。使用mELISA软件对采集到的原始OD值进行处理,以绘制标准曲线并算出蛋白的浓度。随后,使用SPSS17.0软件的t检验对这些蛋白的差异水平进行验证,根据统计分析结果探讨蛋白表达水平在相应脂质代谢通路中可能起到的作用。
【结果】
1.用液相色谱串联质谱法分析Health组与IS组的血浆样品,根据信噪比大于3的原则选取分离的组分,结果显示在血浆样品中分离出84种组分。然后通过SPSS软件进行t检验(P<0.05),筛选出了17种差异组分用于后续的代谢组学分析。
2.采用OPLS-DA对Health组与IS组进行判别分析的结果显示类二十烷酸脂质差异化合物可用于区分健康与缺血性脑卒中(R2Y=0.772,Q2=0.752)。在Health组与IS组之间的17种类二十烷酸脂质差异化合物中,逐步逻辑回归确定了一个分类模型,该模型是综合了五种脂质分子:8-iso-15-keto-PGF2α,13-HODE,AA,DHA和高密度脂蛋白(HDL)。该模型(AUC=0.9899)可以有效识别缺血性脑卒中和健康之间的状态,其诊断缺血性脑卒中的准确率为95.77%,灵敏度为100%,特异性为93.18%。其中,缺血性中风患者的AA呈上升趋势,其余四者呈下降趋势。该模型优于包含HDL,甘油三酸酯(TG)和血糖的传统模型(AUC=0.8527),其准确度为81.69%,敏感性为77.78%,特异性为84.09%。
3.采用OPLS-DA对FS组与RS组初步判别分析的结果表明,存在类二十烷酸脂质差异化合物可用于缺血性脑卒中首发性和复发性的区分(R2Y=0.643,Q2=0.577)。随后,逐步逻辑回归分析结果显示通过两种类二十烷酸脂质代谢物(包括11-HETE和8-iso-15-keto-PGF2α)的组合,建立了一个分类模型用以区分首发缺血性脑卒中与复发性缺血性脑卒中。相对于首发缺血性脑卒中患者,代谢物8-iso15-keto-PGF2α在复发性缺血性脑卒中患者体内是上调的,11-HETE则呈现下调的趋势。这个由两种类二十烷酸脂质代谢物组成的模型通过随机森林算法的诊断准确性为92.86%(AUC=0.9118),灵敏度为94.12%,特异性为87.50%。
4.通过ELISA技术检测了类二十烷酸脂质代谢通路中的6种蛋白,分别是ALOX15、15-OH-PGD2H、CYP2B6、CYP3A4、EPHX2和LOX-1。根据检测结果,这六种蛋白的表达水平在疾病组中都表现出增加的趋势。其中,ALOX15、CYP2B6和EPHX2这三种蛋白的浓度水平具有统计学意义(P<0.05)。
【结论】
在第一部分的研究中,AA、DHA、8-iso-15-keto-PGF2α、14,15-DHET、13-HODE在内的四种脂肪酸结合临床生化参数HDL作为辅助诊断缺血性脑卒中的混合生物标志物具有更高的诊断效率。另外,11-HETE和8-iso-15-keto-PGF2α的分类模型能够辅助诊断区分首次发作和反复发作的缺血性脑卒中。在第二部分的研究中,脂肪酸代谢通路中6种脂质代谢酶在缺血性脑卒中的病理环境中都表现出了上调的趋势。然而,在我们的统计范畴内,LA和AA通过这些酶的相关代谢产物都是呈现下调的趋势,这其中可能存在某种反馈调节机制导致了这种结果,具体的机制还需要进一步的研究。综上所述,类二十烷酸脂质代谢物在血浆中的水平变化研究,为缺血性脑卒中的代谢调节机制研究提供了新的视野。
利用液相色谱串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)联用和靶向代谢组技术,研究健康志愿者(Health组)和缺血性脑卒中(Ischemic stroke, IS)患者血浆中158种类二十烷酸的含量差异。通过多维统计分析结合机器学习的方法筛选可用于辅助诊断缺血性脑卒中的类二十烷酸脂质生物标志物。同时,采用酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)技术检测候选标志物代谢相关蛋白的表达水平,探讨缺血性脑卒中中类二十烷酸水平变化的可能机理。
【方法】
第一部分,设定严格的标准采集了122例健康志愿者和197例缺血性脑卒中患者(包含155例首发缺血性脑卒中患者(First-everischemicstroke,FS)、42例复发性缺血性脑卒中患者(Recurrentstroke,RS))的血液作为实验研究对象。血液样本用含肝素的抗凝管收集,分离血浆后置-80℃冰箱保存。使用固相萃取(Solid phase extraction, SPE)方法对血浆样本中的类二十烷酸脂质代谢物进行提取纯化。以16种同位素标准品作内标,将158个待测组分为16个组,每组用一个同位素内标作为标准,建立了158种脂肪酸代谢物的LC-MS/MS分析方法,用于血浆样品中类二十烷酸的含量分析。采集到的原始数据使用EXCEL进行预处理并标准化,再使用SIMCA-P13.0代谢组学软件中的正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal Partial Least Square-Discriminant Analysis, OPLS-DA)法对该数据集进行处理,用以反映是否存在类二十烷酸差异组分可以区分健康与缺血性脑卒中。使用SPSS对该标准化数据集进行t检验,P<0.05则认为相关组分在两组间具有统计学差异,得以初步筛选出差异组分。然后,将该含候选差异化合物的数据集随机分配为训练集(75%)和验证集(25%),其中训练集衍生疾病风险算法,验证集应用算法并进行测试。使用逐步变量选择和向后消除的逻辑回归模型可最佳区分训练组:Health组与IS组(包含FS和RS),以及FS组与RS组。我们推导了随机森林机器学习算法,以研究候选标记物作为缺血性脑卒中预测的准确性、敏感性和特异性。对于机器学习算法,通过对训练集使用10倍交叉验证来确定判别分析物,以确保其能达到最佳性能。然后,结合接受者操作特性曲线(Receiver operating characteristic curve, ROC)的曲线下面积(Area under the curve, AUC)筛选类二十烷酸特征代谢物。随后,根据该特征代谢物的含量变化,结合脂肪酸的代谢途径对它们进行生物功能分析,并探讨类二十烷酸在缺血性脑卒中发生过程的可能机制。
第二部分,在第一部分的血浆样本中随机选取40例首发缺血性脑卒中患者、40例健康志愿者的血浆作为第二部分的研究对象。采用ELISA技术对前面研究发现的类二十烷酸代谢差异组分的代谢相关蛋白进行分析,探讨其参与调控的机理。使用mELISA软件对采集到的原始OD值进行处理,以绘制标准曲线并算出蛋白的浓度。随后,使用SPSS17.0软件的t检验对这些蛋白的差异水平进行验证,根据统计分析结果探讨蛋白表达水平在相应脂质代谢通路中可能起到的作用。
【结果】
1.用液相色谱串联质谱法分析Health组与IS组的血浆样品,根据信噪比大于3的原则选取分离的组分,结果显示在血浆样品中分离出84种组分。然后通过SPSS软件进行t检验(P<0.05),筛选出了17种差异组分用于后续的代谢组学分析。
2.采用OPLS-DA对Health组与IS组进行判别分析的结果显示类二十烷酸脂质差异化合物可用于区分健康与缺血性脑卒中(R2Y=0.772,Q2=0.752)。在Health组与IS组之间的17种类二十烷酸脂质差异化合物中,逐步逻辑回归确定了一个分类模型,该模型是综合了五种脂质分子:8-iso-15-keto-PGF2α,13-HODE,AA,DHA和高密度脂蛋白(HDL)。该模型(AUC=0.9899)可以有效识别缺血性脑卒中和健康之间的状态,其诊断缺血性脑卒中的准确率为95.77%,灵敏度为100%,特异性为93.18%。其中,缺血性中风患者的AA呈上升趋势,其余四者呈下降趋势。该模型优于包含HDL,甘油三酸酯(TG)和血糖的传统模型(AUC=0.8527),其准确度为81.69%,敏感性为77.78%,特异性为84.09%。
3.采用OPLS-DA对FS组与RS组初步判别分析的结果表明,存在类二十烷酸脂质差异化合物可用于缺血性脑卒中首发性和复发性的区分(R2Y=0.643,Q2=0.577)。随后,逐步逻辑回归分析结果显示通过两种类二十烷酸脂质代谢物(包括11-HETE和8-iso-15-keto-PGF2α)的组合,建立了一个分类模型用以区分首发缺血性脑卒中与复发性缺血性脑卒中。相对于首发缺血性脑卒中患者,代谢物8-iso15-keto-PGF2α在复发性缺血性脑卒中患者体内是上调的,11-HETE则呈现下调的趋势。这个由两种类二十烷酸脂质代谢物组成的模型通过随机森林算法的诊断准确性为92.86%(AUC=0.9118),灵敏度为94.12%,特异性为87.50%。
4.通过ELISA技术检测了类二十烷酸脂质代谢通路中的6种蛋白,分别是ALOX15、15-OH-PGD2H、CYP2B6、CYP3A4、EPHX2和LOX-1。根据检测结果,这六种蛋白的表达水平在疾病组中都表现出增加的趋势。其中,ALOX15、CYP2B6和EPHX2这三种蛋白的浓度水平具有统计学意义(P<0.05)。
【结论】
在第一部分的研究中,AA、DHA、8-iso-15-keto-PGF2α、14,15-DHET、13-HODE在内的四种脂肪酸结合临床生化参数HDL作为辅助诊断缺血性脑卒中的混合生物标志物具有更高的诊断效率。另外,11-HETE和8-iso-15-keto-PGF2α的分类模型能够辅助诊断区分首次发作和反复发作的缺血性脑卒中。在第二部分的研究中,脂肪酸代谢通路中6种脂质代谢酶在缺血性脑卒中的病理环境中都表现出了上调的趋势。然而,在我们的统计范畴内,LA和AA通过这些酶的相关代谢产物都是呈现下调的趋势,这其中可能存在某种反馈调节机制导致了这种结果,具体的机制还需要进一步的研究。综上所述,类二十烷酸脂质代谢物在血浆中的水平变化研究,为缺血性脑卒中的代谢调节机制研究提供了新的视野。