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呋喃唑酮，属于硝基呋喃类药物，是人工合成的抗菌药，在畜禽水产养殖中广泛应用，长期摄入呋喃唑酮可导致毒性反应，危害人体健康。由于目前呋喃唑酮违法使用现象仍然存在，有必要加强监控。硝基呋喃原药不稳定，半衰期只有几个小时，其代谢物(AOZ)在动物体内消除缓慢，以共价键的形式与蛋白结合，在适当的酸性条件下能通过水解从蛋白质中释放出来，因此通常将AOZ作为监测呋喃唑酮的靶化合物。
免疫分析方法被认为是一种灵敏、高效、稳定、低成本的微量农药残留筛查检测手段，可弥补大型精密仪器确证技术和酶法检测技术的不足，在食品安全监测中具有突出优势。抗体的制备是免疫分析法的关键，但AOZ分子量小，且空间结构过于简单，难以制备出针对AOZ的特异性抗体，因此需要对AOZ进行衍生修饰以制备针对其衍生物的特异性抗体。基因工程抗体技术，特别是噬菌体抗体库技术的出现，给快速制备低成本抗体提供了一条新途径。本论文在前期获得分泌产生抗AOZ衍生物(NPAOZ)单克隆抗体的杂交瘤细胞的基础上，采用噬菌体抗体库技术，构建抗NPAOZ噬菌体单链抗体文库并实现该抗体在大肠杆菌中的表达，主要研究内容及结果如下：
(1)成功构建抗NPAOZ噬菌体单链抗体文库，富集筛选得到特异性抗NPAOZ噬菌体单链抗体。从分泌产生抗NPAOZ单克隆抗体的杂交瘤细胞CB2-E3中提取总RNA，逆转录合成cDNA第一链，设计引物，PCR扩增抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)片段，大小分别为327 bp和366 bp。VL片段与VH片段先后亚克隆到的噬菌粒载体pSEX81中，电转化大肠杆菌(Eo.coli) XLl-Blue感受态细胞，经辅助噬菌体Hyperphage超感染，构建了库容量为2x106的噬菌体单链抗体库，随机挑取8个克隆进行PCR及EeoR I和BamH I双酶切鉴定scFv片段插入率，结果显示pSEXSl-seFv片段插入率为100％。以AOZ-COOH-OVA为固相抗原，对构建文库进行4轮富集，同时以phage-ELISA分析各轮噬菌体克隆展示抗体与抗原的结合活性。结果显示，从第3、4轮共188个克隆中，有9个呈现明显的特异性反应。
(2)初步展开特异性抗NPAOZ scFv的生物信息研究。9个克隆测序结果显示，scFv片段DNA序列同源性为99.89％，由此推导的氨基酸序列相同。ProtParam软件预测该抗体分子量为26958.0，分子式为C1198HI812N210O380S10。VH和VL片段氨基酸残基均含有4个FR区和3个CDR区。同源性分析显示AOZ-VH氨基酸序列与一鼠源性细胞色素氧化酶单链抗体产生的VH高度同源(83％)，AOZ-VL氨基酸序列与一鼠源性肉毒菌神经毒素单链抗体产生的VL高度同源(78％)。二级结构预测显示scFv含a螺旋12处，β转角23处，无规则卷曲113处。三级结构预测显示VH和VL牵拉而相互靠近，形成环桶状结构，可能为抗原识别区域。
(3)成功构建大肠杆菌表达载体pBV220-scFv，实现重组抗体的表达及特性鉴定。以pSEX81-scFv质粒为模板，扩增scFv基因及6个组氨酸(6xHis)片段，经酶切处理与表达载体pBV220连接，产物转化E.coli BL21感受态细胞。重组菌经温度诱导表达重组单链抗体，SDS-PAGE和Western blot鉴定显示，重组蛋白的分子量接近27 kD，与ProtParam软件预测的分子量大小一致。目标蛋白表达量约占菌体总蛋白的27.82％，且能够被鼠抗His标签单克隆抗体特异性识别。诱导表达的菌液经溶菌酶和超声波结合裂解法处理后，收集包涵体，经提取、变性、Ni-NTA亲和柱纯化、复性及超滤浓缩后，蛋白纯度约为95％。浓缩蛋白用于间接ELISA分析检测。结果显示scFv纯化抗体能识别AOZ-COOH-OVA抗原，对NPAOZ有抑制作用，IC5o值为9.66 ng/mL，线性检测范围(IC2o- IC8o)为0.86～61.74ng/mL，最低检测限(IC10)为0.25ng/mL。