论文部分内容阅读
呋喃唑酮,属于硝基呋喃类药物,是人工合成的抗菌药,在畜禽水产养殖中广泛应用,长期摄入呋喃唑酮可导致毒性反应,危害人体健康。由于目前呋喃唑酮违法使用现象仍然存在,有必要加强监控。硝基呋喃原药不稳定,半衰期只有几个小时,其代谢物(AOZ)在动物体内消除缓慢,以共价键的形式与蛋白结合,在适当的酸性条件下能通过水解从蛋白质中释放出来,因此通常将AOZ作为监测呋喃唑酮的靶化合物。
免疫分析方法被认为是一种灵敏、高效、稳定、低成本的微量农药残留筛查检测手段,可弥补大型精密仪器确证技术和酶法检测技术的不足,在食品安全监测中具有突出优势。抗体的制备是免疫分析法的关键,但AOZ分子量小,且空间结构过于简单,难以制备出针对AOZ的特异性抗体,因此需要对AOZ进行衍生修饰以制备针对其衍生物的特异性抗体。基因工程抗体技术,特别是噬菌体抗体库技术的出现,给快速制备低成本抗体提供了一条新途径。本论文在前期获得分泌产生抗AOZ衍生物(NPAOZ)单克隆抗体的杂交瘤细胞的基础上,采用噬菌体抗体库技术,构建抗NPAOZ噬菌体单链抗体文库并实现该抗体在大肠杆菌中的表达,主要研究内容及结果如下:
(1)成功构建抗NPAOZ噬菌体单链抗体文库,富集筛选得到特异性抗NPAOZ噬菌体单链抗体。从分泌产生抗NPAOZ单克隆抗体的杂交瘤细胞CB2-E3中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一链,设计引物,PCR扩增抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)片段,大小分别为327 bp和366 bp。VL片段与VH片段先后亚克隆到的噬菌粒载体pSEX81中,电转化大肠杆菌(Eo.coli) XLl-Blue感受态细胞,经辅助噬菌体Hyperphage超感染,构建了库容量为2x106的噬菌体单链抗体库,随机挑取8个克隆进行PCR及EeoR I和BamH I双酶切鉴定scFv片段插入率,结果显示pSEXSl-seFv片段插入率为100%。以AOZ-COOH-OVA为固相抗原,对构建文库进行4轮富集,同时以phage-ELISA分析各轮噬菌体克隆展示抗体与抗原的结合活性。结果显示,从第3、4轮共188个克隆中,有9个呈现明显的特异性反应。
(2)初步展开特异性抗NPAOZ scFv的生物信息研究。9个克隆测序结果显示,scFv片段DNA序列同源性为99.89%,由此推导的氨基酸序列相同。ProtParam软件预测该抗体分子量为26958.0,分子式为C1198HI812N210O380S10。VH和VL片段氨基酸残基均含有4个FR区和3个CDR区。同源性分析显示AOZ-VH氨基酸序列与一鼠源性细胞色素氧化酶单链抗体产生的VH高度同源(83%),AOZ-VL氨基酸序列与一鼠源性肉毒菌神经毒素单链抗体产生的VL高度同源(78%)。二级结构预测显示scFv含a螺旋12处,β转角23处,无规则卷曲113处。三级结构预测显示VH和VL牵拉而相互靠近,形成环桶状结构,可能为抗原识别区域。
(3)成功构建大肠杆菌表达载体pBV220-scFv,实现重组抗体的表达及特性鉴定。以pSEX81-scFv质粒为模板,扩增scFv基因及6个组氨酸(6xHis)片段,经酶切处理与表达载体pBV220连接,产物转化E.coli BL21感受态细胞。重组菌经温度诱导表达重组单链抗体,SDS-PAGE和Western blot鉴定显示,重组蛋白的分子量接近27 kD,与ProtParam软件预测的分子量大小一致。目标蛋白表达量约占菌体总蛋白的27.82%,且能够被鼠抗His标签单克隆抗体特异性识别。诱导表达的菌液经溶菌酶和超声波结合裂解法处理后,收集包涵体,经提取、变性、Ni-NTA亲和柱纯化、复性及超滤浓缩后,蛋白纯度约为95%。浓缩蛋白用于间接ELISA分析检测。结果显示scFv纯化抗体能识别AOZ-COOH-OVA抗原,对NPAOZ有抑制作用,IC5o值为9.66 ng/mL,线性检测范围(IC2o- IC8o)为0.86~61.74ng/mL,最低检测限(IC10)为0.25ng/mL。