目的:在全球癌症统计中胃癌仍然是第五大最常见癌症和第三大癌症死亡原因。造成胃癌患者预后不良的主要原因之一是肿瘤的转移,其中腹膜转移是胃癌最主要的转移形式,发生腹膜转移后中位生存时间仅有3-6个月。然而,胃癌腹膜转移的机制并不完全清楚。因此,深入研究胃癌腹膜转移的发生发展机制,寻找关键生物标志物和良好的治疗靶点对于预防和治疗腹膜转移有重要意义。腹膜转移的发生是肿瘤细胞与腹膜微环境相互作用的结果。腹腔脱落癌细胞首先粘附于腹膜的第一道屏障即人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMCs),使间皮细胞发生损伤后,浸润间皮下组织,改变腹膜微环境使其适合转移癌的定植。本课题组之前的研究表明,胃癌细胞分泌转化生长因子β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)是诱导间皮细胞凋亡、纤维化的主要可溶性因子。TGF-β1是TGF-β家族的成员之一,是一种具有多种功能的细胞因子。TGF-β1在胚胎发育、生理状态和疾病状态均扮演着重要的角色,如细胞外基质沉积、细胞周期控制和免疫应答。近年来TGF-β1被报道调节一些细胞自噬水平。自噬是通过自噬体的形成和溶酶体的降解来大量降解细胞内成分的过程,对细胞正常增殖和分化的稳态至关重要,也是在应激状态下细胞维持活力的一种适应性反应。将细胞内受损、变性、衰老或非功能性的蛋白质及细胞器等亚细胞成分运输至溶酶体进行降解和循环利用,以维持细胞自身结构、功能和代谢的稳定。有趣的是,实验证明TGF-β1对细胞自噬的调节作用是不同的,如TGF-β1可以促进血管内皮细胞和肾小管上皮细胞的自噬,但抑制特发性肺纤维化患者成纤维细胞的自噬过程。胃癌腹膜转移过程中癌细胞通过分泌TGF-β1改变腹腔微环境,使其形成有利于肿瘤定植的场所。在这一过程中TGF-β1能否调节腹膜间皮细胞的自噬以及间皮细胞自噬对胃癌腹膜转移的影响还有待研究。鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase,SPHK1)是一种广泛表达的进化保守酶,催化鞘氨醇(sphingosin)磷酸化为鞘氨醇-1磷酸盐(sphingosine1-phosphate,S1P)。SPHK1被证明可以广泛调节多种细胞过程,包括促进细胞增殖、存活和运动。越来越多的证据表明SPHK1参与多种人类癌症进程,包括卵巢癌、肝癌、白血病和胃肠道肿瘤等,SPHK1在肿瘤中的异常表达促进了肿瘤细胞的增殖、迁移和耐药。然而目前有关SPHK1在肿瘤间质细胞的研究还很匮乏。最近研究报道,发现SPHK1也参与了一些细胞和组织自噬的调控,包括神经元细胞、肾小管上皮细胞和肿瘤细胞。对于SPHK1是否参与调控腹膜间皮细胞的自噬还未见报道。在本研究中,我们将通过胃癌细胞与间皮细胞共培养体系,研究胃癌细胞分泌TGF-β1对间皮细胞自噬的影响,以及SPHK1是否参与TGF-β1对间皮细胞自噬的调控,并探讨间皮细胞自噬与纤维化的关系。方法:1、选取120例接受根治性手术胃癌患者腹膜组织标本,免疫组化检测腹膜间皮细胞中SPHK1和自噬相关蛋白LC3B的表达,分析其与临床病理因素及预后的关系。2、通过Western Blot、ELISA方法检测几种胃癌细胞系中TGF-β1表达,选择高表达TGF-β1的胃癌细胞系。利用短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体稳定沉默胃癌细胞TGF-β1。利用Transell小室建立胃癌细胞与间皮细胞共培养体系。Western Blot检测胃癌细胞分泌TGF-β1对间皮自噬相关标志蛋白和SPHK1表达的影响,荧光共聚焦显微镜检测间皮细胞自噬小体的形成。使用shRNA靶向沉默间皮细胞SPHK1,Western Blot、荧光共聚焦显微镜和透射电镜检测间皮细胞SPHK1表达对胃癌细胞诱导的间皮细胞自噬的影响。3、在体外,通过胃癌细胞-间皮细胞粘附实验和Transell侵袭实验分别检测SPHK1调控的间皮细胞自噬对胃癌细胞粘附和侵袭能力的影响;在体内,利用胃癌细胞与间皮细胞混合对裸鼠腹腔注射,检测间皮细胞SPHK1表达对胃癌腹膜成瘤能力的影响。4、Western Blot检测共培养体系下TGF-β1/SPHK1通路对间皮细胞纤维化的影响。利用自噬抑制剂3-甲基嘌呤检测自噬被抑制后间皮细胞纤维化相关蛋白的变化。结果:1、对120例胃癌患者腹膜组织免疫组化结果显示,腹膜间皮细胞SPHK1表达与LC3B表达呈正相关(Pearson检验,r=0.456,P<0.001)。SPHK1高表达与肿瘤大小、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、LC3B高表达、腹膜复发显著相关(P值均<0.05)。Kaplan-Meier分析显示SPHK1和LC3B表达高的患者总生存均较短(PSPHK1<0.001,PLC3B=0.009)。在COX多因素分析中进一步证实SPHK1是一个独立的预后因素(HR=1.826,95%CI:1.057-3.155,P=0.031)。2、Western blot、ELISA检测胃癌细胞系MKN45、MKN28、SGC-7901、MGC-803、BGC-823中的TGF-β1表达水平,结果显示,SGC-7901细胞系内和外分泌TGF-β1蛋白水平最高,因此确定SGC-7901后续用于与间皮细胞共培养的理想胃癌细胞株。使用shRNA干扰SGC-7901中TGF-β1表达。shCtrl和shTGF-β1SGC-7901细胞分别与间皮细胞共培养,TGF-β1沉默组共培养的间皮细胞自噬水平减弱。类似地,在共培养体系加入TGF-β1受体抑制剂后抑制了SGC-7901细胞对间皮细胞自噬的诱导。3、沉默SGC-7901细胞TGF-β1或加入TGF-β1受体抑制剂阻断胃癌细胞TGF-β1对间皮细胞作用后,间皮细胞SPHK1表达减少。当干扰间皮细胞SPHK1表达后,SGC-7901细胞分泌的TGF-β1对间皮细胞自噬的激活被抑制。4、体外功能实验发现,间皮细胞自噬促进胃癌细胞SGC-7901、MGC-803的粘附和侵袭。当靶向沉默间皮细胞SPHK1,胃癌癌细胞对间皮细胞的粘附和侵袭被抑制。裸鼠腹腔成瘤结果显示,沉默间皮细胞SPHK1对胃癌腹腔成瘤能力明显弱于对照组间皮细胞。5、Western blot进一步检测发现间皮细胞SPHK1同样调控了SGC-7901细胞诱导的间皮细胞纤维化,过表达SPHK1同时激活间皮细胞自噬和纤维化,而自噬抑制剂3-甲基嘌呤抑制间皮细胞自噬的同时使纤维化发生了一定程度的逆转。结论:腹膜间皮细胞SPHK1表达与胃癌患者腹膜转移和预后相关,胃癌细胞通过分泌TGF-β1上调间皮细胞SPHK1从而激活间皮细胞自噬,SPHK1诱导的间皮细胞自噬有利于维持其纤维化表型并促进胃癌细胞粘附、侵袭和腹膜转移的发生。本研究结果为胃癌腹膜转移机制提供了新的思路和潜在的治疗靶点。