课题背景：随着社会经济的发展和生活水平的提高,疾病谱也发生了改变。感染性疾病负担减轻,而包括恶性肿瘤在内的慢性非感染性疾病和伤害逐渐成为发达国家和发展中国家的疾病主要负担。据中国肿瘤登记中心所提供资料显示：我国恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年增加,我国城市居民主要疾病死亡率位居首位的是恶性肿瘤,恶性肿瘤已成为严重威胁我国居民健康的疾病之一。目前,手术、化疗、放疗是临床上治疗肿瘤的基本方法,但副作用严重,疗效欠佳,预后差且价格昂贵。因此,研制开发防治肿瘤的药物已成为当今医学界的热点问题。随着对肿瘤研究的深入,发现原发肿瘤的生长和肿瘤细胞的转移均依赖于新生血管的长入,来为肿瘤的增长提供充足的营养。肿瘤新生血管的形成是以血管生成的方式发生的,若能够抑制肿瘤组织的血管生成,切断肿瘤的营养供应,势必可以达到抑制肿瘤生长和转移的目的,因此,“抗血管生成疗法”或“饥饿疗法”很快被提出并成为一种治疗肿瘤的新方法。近年来,一些体外研究实验均显示,抑制肿瘤细胞新生血管的形成,可达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。2004年FDA批准抗血管生成药物贝伐单抗,用于治疗结直肠癌,可有效的延长病人的生存期。这些研究均证实抗血管生疗法治疗肿瘤的科学性和有效性。血管生成是一个受众多生长因子调节的复杂的生理、病理过程,在这些生长因子中,VEGF是目前已知作用最强、专属性最高的促血管生长因子,它能够增加血管通透性,促进肿瘤血管形成,对肿瘤血管内皮细胞的增殖和迁移发挥重要作用,以VEGF及其受体作用途径中的任一环节为靶点,阻断VEGF对肿瘤血管的作用,都可以达到遏制肿瘤生长和转移的目的,所以,VEGF及其受体是研究血管生成抑制剂作用机制的基本靶点。中医中药治疗疾病(包括肿瘤)有上千年的历史,积累了丰富的临床资料,而且我国中药资源广博,因此,从天然药物尤其是传统中药中寻找安全有效的肿瘤血管生成抑制剂是新药研发领域的重要课题和全新方向。近年来,斑马鱼因具有养殖和繁殖容易、胚胎发育迅速等生物学特点,逐渐被用于筛选抗血管生成药物,其具有以下独特的优势：①高通量(相对于其他体内试验)、操作简单。②筛选周期短。斑马鱼的胚胎发育速度快,24-72小时即可得到试验结果。③胚胎透明、易观察。斑马鱼的胚胎是透明的,很容易观察其活体状态下器官发育、血管生成情况。④样品用量少,且为活体动物实验。⑤用药简单。待测化合物可以直接溶于水中并扩散到胚胎中,也可直接注射到胚胎。⑥与人类具有高度相关性,筛选准确率高。⑦成本低。斑马鱼的饲养、繁殖成本远低于其他实验动物。近年来有研究表明：人参皂苷Rg3、姜黄素、去甲斑蝥素、羟基红花黄色素A、青蒿琥酯、靛玉红具有抗血管生成的作用。这些中药活性成分除斑马鱼模型外在其它模型上证实有抗血管生成作用,考虑到在斑马鱼模型上其发生抗血管生成效果的可能性更大,因此选用了这六种中药活性成分。本研究以转基因斑马鱼胚胎为动物模型,利用体视荧光显微镜观察中药活性成分对其体节间血管生成抑制效果,从分子生物学角度初步研究抗血管生成机制,同时为斑马鱼抗血管生成中药活性成分筛选的适用性和可行性提供实验依据。实验方法：1、选用带有血管内皮细胞或者其前体细胞的特异性标记物fli1的转基因斑马鱼(tgflil:eGFP)为筛选药物的实验动物。筛选前一天,挑选tgflil:eGFP转基因斑马鱼纯合子和AB野生型斑马鱼放于交配盒中,第二天早晨光照刺激产卵,收集半小时内的胚胎放于盛有胚胎培养液的培养皿中,置于28.5。C孵化箱培养。当胚胎发育至10hpf时转移至盛有胚胎培养液的24孔板中,每个孔放入10个胚胎备用。胚胎发育至12hpf时,将配置好的药液依次加入24孔板中。每种药液分高、中、低个三个浓度。选择初步有抑制血管生成效果的药液及其浓度,每种药液浓度平行5个孔重复实验。于同一培养板中,留出2列孔,1列加阳性对照药物(SU5416),1列不予加药,1列DMSO组。中药活性成分均用二甲基亚砜(DMSO)溶解。胚胎发育至48hpf,用OLYMPUS MVX10体式荧光显微镜观察。挑选抗血管生成有效中药的胚胎指标如下：与同时期野生型AB斑马鱼胚胎相比大体形态发育正常；fli1基因荧光表达强度减弱、缺失或者血管荧光分布紊乱等荧光表达异常的胚胎。2、针对筛选有效的目标单体,进行初步机制研究。首先利用整体原位杂交(WISH)的方法,初步预测(定性)其flkl mRNA的表达情况,实验设计分正常组和试验组,收集48hpf斑马鱼胚胎(方法同前),体视荧光显微镜观察拍照。然后利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法,定量分析其flkl mRNA表达规律,实验设计分处理组和空白对照组,收集48hpf斑马鱼胚胎(方法同前)。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,凝胶成像系统捕获图像,利用Band Scan5.0软件获得具体数据。3、实验数据用均数、标准差表示。多个样本均数间的比较用单因素方差分析。使用One-Way ANOVA分析后,若方差不齐,使用近似F检验的Welch法和Brown-Forsythe法,然后运用基于方差不齐的多重比较方法Dunnet’ts T3和Dunnet’ts C。以上数据均用SPSS13.0进行统计分析。显著性水平P<0.01。主要结果：1、中药活性成分筛选结果(1)人参皂苷Rg3、姜黄素无明显抑制血管生成效果,其中人参皂苷Rg3浓度0.02～0.16μg/μl时,斑马鱼均于24hpf死亡,姜黄素0.016～0.060.16μg/μl时,每组中有8条斑马鱼死亡。但二者小于死亡浓度时,对血管亦无抑制作用。(2)去甲斑蝥素,未观察到抑制血管效果,一定浓度对斑马鱼有毒性,浓度在0.0250.16μg/μl就会发生死亡。(3)羟基红花黄色素A,当浓度达到80.16μg/μl～100.16μg/μl鱼尚未发生死亡(48hpf),但脊柱有轻度弯曲,多次重复实验,仅观察到有一条鱼血管比较清晰,仔细观察,抑制血管不明显。所以效果甚微。(4)青蒿琥酯：0.5～0.16μg/μl时,斑马鱼在28hpf均死亡,0.01、0.05、0.1在72hpf均未破膜,手动破膜后,斑马鱼脊柱屈曲,血管有抑制,但不显著,且有死亡迹象。(5)靛玉红,100μM时,鱼胚胎出现畸形死亡,15、30、90μM,其抑制血管的程度逐渐加重,但其发育正常,10条斑马鱼中有8条发生不同程度的抑制血管作用。2、青蒿琥酯对斑马鱼体节间血管生成的观察二甲基亚砜组与空白对照组相比,体节间血管长度无差异(P>0.05)；与空白对照组相比,青蒿琥酯各剂量组有差异(P<0.01),但并不显著,未显示剂量依赖性。3、靛玉红对斑马鱼胚胎体节间血管生成的观察二甲基亚砜组与空白对照组相比,体节间血管长度无差异(P>0.05)；与空白对照组相比,靛玉红各剂量组体节间血管长度有显著性差异(P<0.01),且呈剂量依赖性抑制。4、青蒿琥酯对tgflil:eGFP斑马鱼胚胎flk1基因表达的影响与空白对照组相比,青蒿琥酯处理组的基因信号减少,但不显著；与空白对照组比,青蒿琥酯低剂量组无显著差异(P>0.05),青蒿琥酯中、高剂量组有显著差异(P<0.0,)。5、靛玉红对tgflil:eGFP斑马鱼胚胎flk1基因表达的影响与空白对照组相比,靛玉红处理组的基因信号显著减少；靛玉红对斑马鱼胚胎的flklmRNA的表达水平有明显的抑制作用,并随浓度的增高而增加,与空白对照组相比,有显著性差异(P<0.01)。结论：1、斑马鱼具有体积小、胚胎透明、繁殖速度快等优势。本研究选用的tgflil:eGFP斑马鱼是将GFP(绿色荧光蛋白)标记插入到fli1基因的启动子序列中,得到了在血管内皮细胞表面表达GFP的转基因斑马鱼,在荧光显微镜下就可以清晰地观察和定量分析药物对血管生成的影响。研究表明,此模型较人脐静脉内皮细胞、鸡胚尿囊膜模型更简便易行,适用于中药抗血管生成活性成分筛选。2、六种中药活性成分抗血管生成观察结果提示：除青蒿琥酯、靛玉红外,其余四种单体无明显抑制斑马鱼胚胎血管生成效果,且有致畸、发育迟缓、毒性等作用。靛玉红抑制斑马鱼体节血管生成效果显著,但浓度高于100μM,亦可致畸或致死。3、与空白对照组相比,青蒿琥酯、靛玉红能够抑制斑马鱼胚胎体节间血管生成,而且后者呈剂量依赖性。4、WISH、RT-PCR结果显示,青蒿琥酯处理的斑马鱼胚胎flklmRNA的表达水平有较轻的抑制作用,且其抑制无明显剂量依赖关系；靛玉红处理的转基因斑马鱼胚胎的JlklmRNA显著减少,且随着药物浓度的增加,flklmRNA的表达随之减少。提示：靛玉红可能通过抑制VEGFR2与VEGF结合后的信号通路的某个环节来阻断胞内蛋白磷酸化,从而影响VEGFR2基因的表达。综上所述,本实验运用转基因斑马鱼模型,通过体视荧光显微镜下血管荧光的观察及血管特异性基因(flk1)表达分析,发现除青蒿琥酯、靛玉红外,其余四种中药单体无明显抑制斑马鱼胚胎血管生成效果,而靛玉红能够抑制斑马鱼胚胎体节间血管生成,且呈剂量依赖性,随其药物浓度的增加,flklmRNA的表达随之减少,提示：靛玉红可能通过抑制VEGFR2与VEGF结合后的信号通路的某个环节来阻断胞内蛋白磷酸化,从而影响VEGFR2基因的表达。