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柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)引起的柑橘衰退病是柑橘生产中为害最严重的病毒病之一，目前生产上主要采用无毒苗木、弱毒株系交叉保护和抗性品种等进行防治。MicroRNA(miRNA)是一类大小约22nt的内源非编码小RNA，在基因表达、基因组表观遗传修饰和抗病毒等方面起着重要的调控作用。分子生物学的发展为快速有效培育抗CTV柑橘品种和筛选弱毒株系等带来新的希望。新一代测序技术为miRNA的分离和鉴定提供了高效的分析平台，本实验利用该技术寻找鉴定甜橙实生苗中的miRNA，并预测其靶基因、作用位点和调控基因等，为开展甜橙与病原物互作机理、分子品种改良等研究奠定了基础。本研究以甜橙和CTV为研究对象，通过高通量测序技术获得小RNA序列文库，利用生物信息学软件和数据库，进行甜橙miRNA鉴定和靶基因预测；利用GO、KEGG数据库对靶基因进行功能分类、通路分析等。主要获得以下结果：1、首次建立了一步法RT-LAMP检测CTV技术。该技术灵敏度是普通RT-PCR检测技术的100倍，具有准确、便捷、经济等特点，满足基层、科研单位等对柑橘衰退病检测的需要。2、田间捕捉褐色橘蚜，挑取若虫进行脱毒，获得无毒褐色橘蚜。同时，对具有拮抗作用的CTV分离株CT11和CT14进行单蚜传毒，获得蚜传分离株系CT11A和CT14A。3、完成了两个蚜传分离株的全基因组序列克隆，CT11A和CT14A基因组全长分别为19253nt和19247nt，GenBank登录号分别为JQ911664和JQ911663。构建了GenBank中27个CTV分离株的全基因组遗传进化树，所有分离株聚为6个族群，其中，CT11A归属VT族群，CT14A归属B165族群。CT11A与T318A最近，全基因组序列一致性98.89%，多变区域序列一致性为99.57%；与T36最远，全基因组序列一致性80.20%，高变异区序列一致性42.14%。CT14A与B165最近，全基因组序列一致性94.57%，高变异区基因序列一致性99.64%。CT11A和CT14A全基因组序列一致性92.37%，基因组的高变异区序列一致性为50.52%。p25和p23基因用HinfⅠ和RsaⅠ进行单酶切时，酶切图谱存在显著差异，预测结果与前人实验结果一致。2株系的5′-UTR、3′-UTR、HR、p23、p20和p25基因二级结构存在明显差异。4、小RNA文库高通量测序数据分析(1)利用Illumina高通量测序技术构建了4个不同情况下甜橙小RNA文库，并鉴别出一批保守miRNA和候选miRNA。CTV侵染的甜橙小RNA文库以21nt的小RNA最多，未侵染文库以24nt的小RNA最多。小RNA序列5′端多数为―U‖，甜橙基因组上存在产生小RNA的热点区域。(2)将4个小RNA库中miRNA数量归一化，比较miRNA表达量差异。结果显示：在CTV侵染甜橙样品中与对照样品相比，有76个miRNA表达量下降，99个miRNA表达量上升。5、miRNA的功能初步预测分析(1)预测出一批miRNA的靶标基因，miRNA与靶基因存在一对一、一对多和多对一的对应关系。(2)GO数据库富集显著性分析结果，最显著关联的为生物学过程。生物过程中主要与细胞互作、细胞发育、DNA的转录翻译、RNA合成和木质素合成等过程关联极显著。KEGG数据库靶基因代谢通路富集分析结果，映射显著的通路有植物与病原物互作、抗原加工与提呈、RNA转运和真核细胞的核糖体合成等。病原物与植物通路分析显示，CTV侵染甜橙引起显著变化的主要有RAR1、WRKY25、WRKY33和RBOH因子，强株系侵染时与CaMCML显著关联，而弱毒株系侵染时没有miRNA的靶基因与其相关联。6、构建了CT11A和CT14A株系的小RNA文库。该2株系产生的小RNA中均以22nt最多，其次为21nt，分别占总量的45.24%~52.50%和31.95~35.46%左右。小RNA序列在基因组上呈非均匀分布，其热点区域主要分布在基因组3′端区域。