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研究目的：
1、明确RUNX3基因在正常膀胱组织和膀胱癌T24细胞株的表达情况。
2、明确RUNX3基因在膀胱癌T24细胞株中发生甲基化。
3、构建含有RLJNX3基因的RUNX3-EGFP-pDest质粒。
4、在Lipefectamine2000介导下应用质粒转染膀胱癌T24.细胞株，探讨RUNX3抑癌基因恢复表达后对膀胱癌细胞凋亡的影响。
方法与结果：
一、正常膀胱组织的获取及细胞培养
正常膀胱组织标本取白肾结石拟行经皮肾镜碎石取石术患者，患者均无膀胱疾病。在膀胱镜逆行插管时活检钳钳取正常膀胱组织，0.5h内将获取的组织液氮速冻后，转-80℃冰箱保存。
膀胱癌T24细胞株，培育在含10﹪胎牛血清的RPMI-1640培养液中，37℃、5﹪CO<,2>培养箱中培养。每2d-3d换液，长满80-90﹪传代。
二、RT-PCR检测正常膀胱组织、膀胱癌T24细胞中RUNX3基因的表达
应用总RNA提取纯化系统分别抽提2例正常膀胱组织、2组膀胱癌T24细胞的总RNA，反转录成cDNA，然后将cDNA产物进行PCR扩增RUNX3基因。
结果：2例正常膀胱组织RT-PCR.均可检测出1248bp的RUNX3基因条带，而2组膀胱癌T24细胞中均无法检测出RUNX3基因的表达。
三、应用甲基化特异性PCR和非甲基化PCR检测正常膀胱组织和膀胱癌T24细胞RUNX3基因启动子区域CpG岛的甲基化
应用E.Z.N.A.SQ Tissue DNA Kit试剂盒分别提取正常膀胱组织和T24细胞的基因组。对基因组进行亚硫酸氢钠修饰，玻璃奶法回收DNA，按照参考文献[10]合成DNA甲基化和未甲基化的特异引物，PCR仪进行甲基化特异性PCR，非甲基化PCR则不进行修饰，直接在PCR仪进行非甲基化PCR检测。取10ul反应产物，进行电泳及分析。
结果：正常膀胱组织RUNX3基因甲基化PCR检测阴性，非甲基化PCR阳性。膀胱癌T24细胞RUNX3基因甲基化PCR检测阳性，非甲基化PCR阴性。表明正常膀胱组织RUNX3基因正常表达，未发生启动子区域CpG岛甲基化，而膀胱癌T24细胞可能因RUNX3基因启动子区域CpG岛发生甲基化，致RUNX3基因无法表达。
四、构建真核载体的RUNX3-EGFP-pDest质粒。
将中山大学生命科学院馈赠pDest47载体(Invitrogerl公司，美国)，在载体上加入5端多克隆位点：XmnI和BstBI，3端多克隆位点xhoI、NotI，构建真核细胞的空质粒载体EGFP-pDest，质粒带有EGFP标签(绿色荧光蛋白基因)，用EGFP-pDest质粒预转染膀胱癌T24细胞，观察转染后有无绿色荧光表达，了解EGFP-pDest质粒是否构建成功。再用NspV和XhoI双酶切RUNX3基因和载体EGFP-pDest，分别纯化后用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化细菌后挑选正确大小的克隆，构建含有RIANX3基因的RUNX3-EGFP-pDest质粒，PCR及双酶切鉴定证实。
EGFP-pDest质粒转染膀胱癌T24细胞后24小时，倒置荧光显微镜下观察膀胱癌T24细胞成功表达绿色荧光，表明EGFP～pDest质粒构建并试转染成功。
将构建的RUNX3-EGFP-pDest质粒使用EGFP特异性引物进行EGFP的PCR鉴定，出现720bp的EGFP标签条带，表明质粒中含有EGFP标签。将质粒使用BSTBI和XHOI双酶切鉴定，出现了1248bp的RUNX3基因片段，表明RUNX3-EGFP-pDest质粒含有目的基因RUNX3。
五、Lipefectamine2000介导下转染膀胱癌T24细胞。
转染实验分为3组：空白对照组(不进行转染)、空质粒EGFP-pDest转染组、RUNX3-EGFP-pDest转染组。转染方法参照Lipofectamine2000试剂说明书进行。
六、Western blot检测RUNX3蛋白表达。
分别提取正常膀胱上皮、膀胱癌T24细胞、EGFP-pDest质粒转染细胞、RUNX3-EGFP-pDest质粒转染细胞的蛋白。Western blot检测RUNX3蛋白表达。
结果：正常膀胱粘膜组和RUNX3-EGFP-pDest质粒转染组Western blot检测，均表达RUNX3蛋白，而膀胱癌T24细胞组和EGFP-pDest质粒转染组未表达RUNX3蛋白，表明RUNX3-EGFFP-pDest质粒将RLINX3基因转染进入T24细胞，并成功表达出RUNX3蛋白。
七、荧光显微镜观察转染情况以及细胞形态变化。
转染后24小时及48小时，在倒置荧光显微镜下，分别用100X、400X放大倍数，先用可见光观察细胞形态，再用470 nm蓝光激发，观察绿色荧光蛋白表达情况。
结果：EGFP-pDest质粒转染组以及RUNX3-EGFP-pDest质粒转染组细胞形态较对照组均发生了一定的变化，2组转染的细胞均出现了一定的细胞死亡，可见细胞碎片，同时，在RUNX3-EGFP-pDest质粒转染组可观察到凋亡细胞：细胞体积明显缩小，细胞核体积缩小，核固缩，无核仁；部分凋亡细胞可见核碎裂，碎裂的核由胞膜包裹并突起于细胞表面形成凋亡小体。
蓝光激发下，EGFP-pDest质粒转染组以及RUNX3-EGFP-pDest质粒转染组均发现绿色荧光细胞，EGFP-pDest质粒转染组发出绿色荧光的细胞较多。表明两组细胞均转染成功，且EGFP-pDest质粒组较RUNX3-EGFP-pDest质粒转染效率高。
48小时后，2组转染的细胞绿色荧光并没有增多，同时发现细胞死亡更多。
八、流式细胞仪检测细胞转染率。
转染后24 h，收集细胞，PBS洗涤2次，采用流式细胞仪检测GFP阳性细胞的百分率。每组取3份样品进行检测，每个样品检测3次。同时以未转染质粒的细胞为对照。实验重复3次，SPSS 13.0统计软件计算，EGFP-pDest空质粒组以及RUNX3-EGFP-pDest质粒组的GFP阳性细胞的百分率分别为(42.9±5.7)﹪，(36.8±5.2)﹪，t检验提示2组间无统计学差异(P>0.05)。而未转染质粒的细胞未发现GFP阳性细胞。九、流式细胞仪检测细胞凋亡。
转染24小时后，分别收集空白对照组、空质粒EGFP-pDest转染组、RUNX3-EGFP-pDest转染组的细胞，按照美国BD公司的Armexin V/FITC Kit说明书处理细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡。
本例共3组，每组重复检测2次，实验重复3次，共18组数据文件，输入SPSS 13.0系统建立数据文件。空白对照组的凋亡率为(3.1±0.46)﹪，而EGFP-pDest转染组和RUNX3-EGFP-pDest质粒转染组的凋亡率分别为(10.1±1.62)﹪、(41.20±1.53)﹪，应用LSD法和SNK法进行均数的多重两两比较，RUNX3-EGFP-pDest质粒转染组与EGFP-pDest转染组、空白对照组凋亡率之间的差异均具有显著性，p<0.01，说明转染野生型RUNX3基因后促进了膀胱癌T24细胞的凋亡。
结论：
1、正常膀胱组织中RUNX3基因正常表达，而膀胱癌T24细胞RUNX3基因未表达。
2、正常膀胱组织RUNX3基因正常表达，未发生启动子区域CpG岛甲基化，而膀胱癌T24细胞可能因RUNX3基因启动子区域CpG岛发生甲基化，致RUNX3基因无法表达。
3、本研究通过酶切连接方法成功构建了携带有RUNX3基因以及绿色荧光蛋白基因EGFP的RUNX3-EGFP-pDest质粒，既能成功转染膀胱癌细胞，又便于直接观察转染效果并进行转染效率的检测。
4、转染野生型RUNX3基因后促进了膀胱癌T24细胞的凋亡。RUNX3-EGFP-pDest质粒转染组与EGFP-pDest转染组、空白对照组凋亡率之间的差异均具有显著性，p<0.01。