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目的：观察锌指转录因子GATA-4基因过表达的骨髓间充质干细胞（MSCs）对心肌梗死后缺血心肌细胞的影响。阐明GATA-4与微小RNA（miR-195）、B-细胞淋巴瘤基因w（Bcl-w）因子之间的关系，探讨GATA-4加强MSCs细胞对梗死后缺血心肌细胞保护作用的可能机制，探寻加强缺血心脏保护的方法，为MSCs细胞移植治疗心肌梗死探索新的途径。方法：1.分离、培养健康新生Spraque-Dawley（SD）大鼠的MSCs细胞。2.构建GATA-4基因重组慢病毒载体，包装产生病毒，转染MSCs细胞并筛选稳定过表达GATA-4的MSCs细胞株。3.免疫荧光检测，蛋白免疫印迹、实时定量PCR等方法验证GATA-4基因在MSCs细胞内过量表达。4.分离、培养健康新生SD大鼠（2-5日龄）的心肌细胞，建立乳鼠心肌细胞和MSCs细胞嵌套共培养体系。5.乳鼠心肌细胞分成五组：正常组、缺氧组、与MSCs细胞共培养组、与MSCNull细胞共培养组和与MSCGATA-4细胞共培养组。除正常组外样本进行细胞缺氧（4%CO2+95%N2）24小时，Annexin V-PE免疫染色后用荧光显微镜及流式细胞术检测心肌细胞凋亡。缺氧36小时检测心肌细胞损伤指标LDH。6.结扎2-3月龄的SD大鼠冠状动脉前降支（LAD），构建心肌梗死模型。实验大鼠分为对照组、MSCbas组、MSCNull组和MSCGATA-4组，每组四只，在梗死周围心肌组织上下左右四点分别注射全培养基、106细胞/50μl IMDM培养基的MSCs细胞、MSCNull细胞和MSCGATA-4细胞。7.细胞注射1周后收获大鼠心脏，横向等分切成0.15cm的切片，TTC染色后计算心肌梗死面积（MIA）。细胞注射4周后，收获大鼠心脏，石蜡包埋切片行Masson三色染色法染色。图像采集后测量计算梗死后纤维化面积。8.从MSCGATA-4细胞中提取包括miRNA的总RNA，用生物芯片（microarray）筛选，发现miR-195表达受到抑制。9. miR-195前体重组慢病毒载体转导MSCs细胞，过表达miR-195；将GATA-4-siRNA转染MSCs细胞，减少MSCs细胞内源性的GATA-4表达。10.蛋白免疫印迹、实时定量PCR分别测定缺氧24小时后MSC、MSCNull组和MSCGATA-4组、GATA-4-siRNA组、miR-195组的GATA-4、Bcl-w蛋白及mRNA的表达。并实时定量PCR法检测MSC组、MSCGATA-4和miR-195组的miRNA的表达水平。11.克隆Bcl-w3′UTR DNA片段，构建双荧光素报告质粒，转染HEK293TN细胞,荧光素酶活性测定及分析，明确miR-195是否通过碱基互补结合Bcl-w mRNA的3′UTR而直接调控Bcl-w的表达。结果：1.本研究成功构建了GATA-4重组慢病毒载体，获得足量、高效过量表达GATA-4基因的MSCs细胞。2.缺氧24h后，心肌细胞凋亡率达到33.7±1.92%，远远大于正常组的8.4±1.1%。嵌套共培养的MSC组和MSCNull组，心肌细胞凋亡率较大幅度下降，分别为25.40±2.1%和26.6±1.5%（p<0.05vs缺氧组），两组之间相比无统计学差异。而共培养的MSCGATA-4组，心肌细胞凋亡率下降为19.7±1.4%(p<0.05vs MSCNull组)。3.缺氧36h后，心肌细胞损伤增加，释放的LDH含量明显升高。缺氧组LDH释放是正常组的420.82±20.55%，与各种MSCs嵌套共培养的MSC组和MSCNull组，这一比值减低到320.00±22.55%和330.62±26.30%（p<0.05vs正常组）。而与转染了GATA-4基因的MSCs(MSCGATA-4)细胞嵌套共培养组为250.87±20.39%。(p<0.05vs MSCNull组)。4.移植后1周后，TTC染色将梗死心脏非缺血区域染为红色，缺血区域拒染而显示为苍白色，测量各个层面的缺血心肌面积，计算出MIA的比率：MSCbas组16.38±2.51%和MSCNull组15.45±1.81%低于对照组media组22.06±3.06%（n=4,p<0.05）。MSCGATA-4进一步使MIA减少到9.52±1.98%(p<0.05vs MSCBas组和MSCNull组, p<0.01vs MSC组)。5.心肌梗死4周后，纤维组织（主要是胶原）替代原来的死亡细胞，采用Masson三色染色法标记出蓝色的纤维组织，计算及纤维化部分的比率及左室前壁厚度与室壁厚度的比值。结果与近期试验结果类似（n=4，p<0.05）。6.经过Microarray筛选，我们发现miR-195在MSCGATA-4中表达明显降低为MSCNul组的0.58±0.14倍（p<0.05）。RT-PCR检查， MSCGATA-4组miR-195的表达量约为MSCNull组的0.52±0.09倍，与Microarray结果一致。当用GATA-4-siRNA将GATA-4基因成功“沉默（silence）”而表达抑制后, miR-195的表达量与MSC组相比，升高了2.36±0.24倍（p<0.05）。7.过表达GATA-4的MSCs细胞Bcl-w表达增加；GATA-4基因静默后Bcl-w表达被逆转。MSC、MSCNull和MSCGATA-4三组细胞缺氧处理24小时后， MSC组和MSCNull组Bcl-w蛋白水平相近（p>0.05）。MSCGATA-4组Bcl-w蛋白表达水平明显升高(p<0.05vs MSC组和MSCNull组)。GATA-4基因成功静默后，MSCs细胞GATA-4蛋白表达减少，与此同时，Bcl-w蛋白和mRNA表达水平均明显降低。8. MSCGATA-4细胞进一步转染miR-195质粒，过表达miR-195后，细胞内高水平表达的Bcl-w蛋白随之下降(p<0.05vs MSCGATA-4组)。9.将Bcl-W3′UTR片段作为插入子，构建双荧光素酶报告质粒。与miR-195过表达质粒共转染293T后，带有Bcl-W3′UTR报告子组的荧光活性，明显减低，而同样与miR-195过表达质粒共转染293T的阴性对照组荧光无变化。这表明：大鼠的Bcl-w3′UTR能直接被miR-195碱基配对结合。内源性的Bcl-w蛋白表达被miR-195所抑制。结论：1.本研究成功构建了GATA-4重组慢病毒载体，获得足量、高效过量表达GATA-4基因的MSCs细胞。2.体外实验结果显示： GATA-4加强MSCs细胞对心肌缺氧细胞的保护作用,使缺氧24h后的心肌细胞凋亡和缺氧36h后的心肌细胞损伤进一步减少。3.体内实验结果显示： GATA-4可加强MSCs细胞对心肌梗死后缺氧心肌细胞的保护作用,使心肌梗死面积和心肌纤维化面积进一步降低。4. miR-195通过与Bcl-w mRNA的3′UTR靶位点互补结合，抑制其翻译来降低Bcl-w蛋白水平。GATA-4抑制miR-195的表达，从而提高Bcl-w表达水平，由此加强MSCs对心肌梗死后缺血心肌的保护作用。