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目的:观察锌指转录因子GATA-4基因过表达的骨髓间充质干细胞(MSCs)对心肌梗死后缺血心肌细胞的影响。阐明GATA-4与微小RNA(miR-195)、B-细胞淋巴瘤基因w(Bcl-w)因子之间的关系,探讨GATA-4加强MSCs细胞对梗死后缺血心肌细胞保护作用的可能机制,探寻加强缺血心脏保护的方法,为MSCs细胞移植治疗心肌梗死探索新的途径。方法:1.分离、培养健康新生Spraque-Dawley(SD)大鼠的MSCs细胞。2.构建GATA-4基因重组慢病毒载体,包装产生病毒,转染MSCs细胞并筛选稳定过表达GATA-4的MSCs细胞株。3.免疫荧光检测,蛋白免疫印迹、实时定量PCR等方法验证GATA-4基因在MSCs细胞内过量表达。4.分离、培养健康新生SD大鼠(2-5日龄)的心肌细胞,建立乳鼠心肌细胞和MSCs细胞嵌套共培养体系。5.乳鼠心肌细胞分成五组:正常组、缺氧组、与MSCs细胞共培养组、与MSCNull细胞共培养组和与MSCGATA-4细胞共培养组。除正常组外样本进行细胞缺氧(4%CO2+95%N2)24小时,Annexin V-PE免疫染色后用荧光显微镜及流式细胞术检测心肌细胞凋亡。缺氧36小时检测心肌细胞损伤指标LDH。6.结扎2-3月龄的SD大鼠冠状动脉前降支(LAD),构建心肌梗死模型。实验大鼠分为对照组、MSCbas组、MSCNull组和MSCGATA-4组,每组四只,在梗死周围心肌组织上下左右四点分别注射全培养基、106细胞/50μl IMDM培养基的MSCs细胞、MSCNull细胞和MSCGATA-4细胞。7.细胞注射1周后收获大鼠心脏,横向等分切成0.15cm的切片,TTC染色后计算心肌梗死面积(MIA)。细胞注射4周后,收获大鼠心脏,石蜡包埋切片行Masson三色染色法染色。图像采集后测量计算梗死后纤维化面积。8.从MSCGATA-4细胞中提取包括miRNA的总RNA,用生物芯片(microarray)筛选,发现miR-195表达受到抑制。9. miR-195前体重组慢病毒载体转导MSCs细胞,过表达miR-195;将GATA-4-siRNA转染MSCs细胞,减少MSCs细胞内源性的GATA-4表达。10.蛋白免疫印迹、实时定量PCR分别测定缺氧24小时后MSC、MSCNull组和MSCGATA-4组、GATA-4-siRNA组、miR-195组的GATA-4、Bcl-w蛋白及mRNA的表达。并实时定量PCR法检测MSC组、MSCGATA-4和miR-195组的miRNA的表达水平。11.克隆Bcl-w3′UTR DNA片段,构建双荧光素报告质粒,转染HEK293TN细胞,荧光素酶活性测定及分析,明确miR-195是否通过碱基互补结合Bcl-w mRNA的3′UTR而直接调控Bcl-w的表达。结果:1.本研究成功构建了GATA-4重组慢病毒载体,获得足量、高效过量表达GATA-4基因的MSCs细胞。2.缺氧24h后,心肌细胞凋亡率达到33.7±1.92%,远远大于正常组的8.4±1.1%。嵌套共培养的MSC组和MSCNull组,心肌细胞凋亡率较大幅度下降,分别为25.40±2.1%和26.6±1.5%(p<0.05vs缺氧组),两组之间相比无统计学差异。而共培养的MSCGATA-4组,心肌细胞凋亡率下降为19.7±1.4%(p<0.05vs MSCNull组)。3.缺氧36h后,心肌细胞损伤增加,释放的LDH含量明显升高。缺氧组LDH释放是正常组的420.82±20.55%,与各种MSCs嵌套共培养的MSC组和MSCNull组,这一比值减低到320.00±22.55%和330.62±26.30%(p<0.05vs正常组)。而与转染了GATA-4基因的MSCs(MSCGATA-4)细胞嵌套共培养组为250.87±20.39%。(p<0.05vs MSCNull组)。4.移植后1周后,TTC染色将梗死心脏非缺血区域染为红色,缺血区域拒染而显示为苍白色,测量各个层面的缺血心肌面积,计算出MIA的比率:MSCbas组16.38±2.51%和MSCNull组15.45±1.81%低于对照组media组22.06±3.06%(n=4,p<0.05)。MSCGATA-4进一步使MIA减少到9.52±1.98%(p<0.05vs MSCBas组和MSCNull组, p<0.01vs MSC组)。5.心肌梗死4周后,纤维组织(主要是胶原)替代原来的死亡细胞,采用Masson三色染色法标记出蓝色的纤维组织,计算及纤维化部分的比率及左室前壁厚度与室壁厚度的比值。结果与近期试验结果类似(n=4,p<0.05)。6.经过Microarray筛选,我们发现miR-195在MSCGATA-4中表达明显降低为MSCNul组的0.58±0.14倍(p<0.05)。RT-PCR检查, MSCGATA-4组miR-195的表达量约为MSCNull组的0.52±0.09倍,与Microarray结果一致。当用GATA-4-siRNA将GATA-4基因成功“沉默(silence)”而表达抑制后, miR-195的表达量与MSC组相比,升高了2.36±0.24倍(p<0.05)。7.过表达GATA-4的MSCs细胞Bcl-w表达增加;GATA-4基因静默后Bcl-w表达被逆转。MSC、MSCNull和MSCGATA-4三组细胞缺氧处理24小时后, MSC组和MSCNull组Bcl-w蛋白水平相近(p>0.05)。MSCGATA-4组Bcl-w蛋白表达水平明显升高(p<0.05vs MSC组和MSCNull组)。GATA-4基因成功静默后,MSCs细胞GATA-4蛋白表达减少,与此同时,Bcl-w蛋白和mRNA表达水平均明显降低。8. MSCGATA-4细胞进一步转染miR-195质粒,过表达miR-195后,细胞内高水平表达的Bcl-w蛋白随之下降(p<0.05vs MSCGATA-4组)。9.将Bcl-W3′UTR片段作为插入子,构建双荧光素酶报告质粒。与miR-195过表达质粒共转染293T后,带有Bcl-W3′UTR报告子组的荧光活性,明显减低,而同样与miR-195过表达质粒共转染293T的阴性对照组荧光无变化。这表明:大鼠的Bcl-w3′UTR能直接被miR-195碱基配对结合。内源性的Bcl-w蛋白表达被miR-195所抑制。结论:1.本研究成功构建了GATA-4重组慢病毒载体,获得足量、高效过量表达GATA-4基因的MSCs细胞。2.体外实验结果显示: GATA-4加强MSCs细胞对心肌缺氧细胞的保护作用,使缺氧24h后的心肌细胞凋亡和缺氧36h后的心肌细胞损伤进一步减少。3.体内实验结果显示: GATA-4可加强MSCs细胞对心肌梗死后缺氧心肌细胞的保护作用,使心肌梗死面积和心肌纤维化面积进一步降低。4. miR-195通过与Bcl-w mRNA的3′UTR靶位点互补结合,抑制其翻译来降低Bcl-w蛋白水平。GATA-4抑制miR-195的表达,从而提高Bcl-w表达水平,由此加强MSCs对心肌梗死后缺血心肌的保护作用。