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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是全球最具破坏性的动物病毒性疫病之一。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus,PRRSV)是PRRS的病原体。PRRSV是属于动脉炎病毒家族的有囊膜包裹的单股、正链RNA病毒。PRRSV具有遗传多样性,且病毒感染后能够引起免疫抑制,并造成持续性感染,因此给防治PRRS带来了巨大的负担和挑战。Ⅰ型干扰素(typeⅠinterferons,Ⅰ-IFNs),干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)以及一些宿主蛋白具有抑制PRRSV复制的能力。本研究通过miR-382-5p筛选了具有抑制PRRSV复制功能的宿主蛋白HSP60(heat shock protein 60)和IFI16(interferonγ-inducible protein 16),并围绕HSP60和IFI16抑制PRRSV复制的作用机制展开研究。研究内容主要包括以下三个方面:1.基于miR-382-5p抗PRRSV基因的筛选miR-382-5p是前期通过高通量测序获得的PRRSV感染MARC-145细胞后差异性表达的宿主micro RNA(miRNA)。MiRNAs是一类广泛存在于真核细胞中保守的非编码RNAs,且作为转录后调控因子参与调控细胞增殖、分化、凋亡和免疫应答等重要的细胞过程。本研究首先发现miR-382-5p可以促进PRRSV的复制,且miR-382-5p可以负向调控poly I:C诱导的Ⅰ型干扰素的产生。此外,miRNAs在转录后水平可以通过与靶基因m RNA的不完全互补配对,造成靶m RNA降解或抑制其翻译从而调控基因表达以及细胞内的生物过程。因此,通过靶基因的预测和初步验证,发现DDX3X、HSP60、IFI16、USP8、FADD和SKP1是miR-382-5p的候选靶基因。随后,通过研究候选靶基因对PRRSV复制的影响,发现HSP60和IFI16具有抑制PRRSV复制的能力。2.HSP60抑制PRRSV复制机制的研究HSP60是细胞内的伴侣蛋白,同时也是免疫系统网络中的一个节点,能够参与调控免疫应答反应以及病毒复制。本研究发现沉默MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)中的HSP60后,PRRSV ORF7的m RNA水平,病毒滴度以及N蛋白的表达水平与对照组相比显著升高;而过表达HSP60后PRRSV的复制能力下降,表明HSP60是抑制PRRSV复制的抗病毒蛋白。随后,双荧光素酶报告基因检测试验和q PCR分析表明HSP60能够促进poly I:C诱导的IFN-β的产生。进一步的研究发现HSP60可以显著增强MAVS诱导的IFN-β的启动子活性,IFN-β以及干扰素刺激基因ISG15和ISG56的m RNA水平,而且随着HSP60剂量的增加,IFN-β、ISG15和ISG56的转录水平也随之增强。此外,沉默细胞中的MAVS后,HSP60不能促进poly I:C诱导的IFN-β启动子活性以及IFN-β的m RNA水平;而在对照组中,HSP60可以显著增强poly I:C诱导的IFN-β的启动子活性和IFN-β的m RNA水平,表明HSP60促进Ⅰ-IFN应答具有MAVS依赖性。免疫共沉淀和激光共聚焦试验结果表明HSP60能够特异性地结合MAVS,并与MAVS共定位;而且,MAVS的N端CARD、PRO结构域和C端TM结构域是MAVS绑定HSP60所必需的。更重要的是,沉默MARC-145细胞中的MAVS后,HSP60不能抑制PRRSV的复制,表明HSP60拮抗PRRSV复制需要MAVS的参与。3.IFI16抑制PRRSV复制机制的研究IFI16是干扰素γ诱导的蛋白,其在调控Ⅰ-IFN应答DNA和RNA病毒的抗病毒免疫中具有广泛的作用。在本研究中通过过表达和siRNA干扰IFI16,从RNA水平和蛋白水平证明了IFI16具有抑制PRRSV复制的能力,是PRRSV的抗病毒蛋白。另外,IFN-β和PRRSV可以诱导IFI16的表达,且IFI16可以促进PRRSV或poly I:C诱导的IFN-β的产生。进一步的研究发现IFI16能够显著增强MAVS诱导的IFN-β的启动子活性,IFN-β的m RNA水平以及干扰素刺激基因ISG15和ISG56的转录水平。而且,MAVS诱导的IFN-β启动子活性以及IFN-β、ISG15和ISG56的m RNA水平随着IFI16剂量的增加而升高。随后发现,沉默细胞中的MAVS后,IFI16不能促进poly I:C诱导的IFN-β的转录。这些结果表明IFI16能够正向调控MAVS介导的Ⅰ-IFN应答。此外,免疫共沉淀结果显示IFI16可以特异性地结合MAVS,且MAVS的N端CARD、PRO结构域和C端TM结构域对于IFI16-MAVS的相互作用是至关重要的。更重要的是,IFI16发挥抗病毒功能具有MAVS依赖性。综上所述,本研究筛选并证明了HSP60和IFI16是抑制PRRSV复制的抗病毒蛋白。此外,HSP60和IFI16能够正向调控MAVS介导的Ⅰ-IFN应答,且HSP60和IFI16发挥抗PRRSV功能具有MAVS依赖性。本研究阐述了HSP60和IFI16在MAVS介导的信号通路中的作用,且揭示了宿主蛋白HSP60和IFI16拮抗PRRSV复制的作用机制,这有助于了解宿主蛋白HSP60和IFI16在RLR信号通路以及病毒调控中的作用,并为病毒防控提供新的思路。