论文部分内容阅读
S cellulosum So0157-2中含丰富的木聚糖降解酶系，至少含有5个GH11家族的木聚糖酶，同时还具有GH8、GH10、GH43及GH52家族的木聚糖酶。实验室前期克隆表达表征了Xyn11A和Xyn11B，结果显示虽然同为11家族的木聚糖酶，Xyn11A为典型内切酶，Xyn11B降解木聚糖仅产生木二糖，各具独特的性质。本研究进一步针对So0157-2中木聚糖酶基因xyn11C构建了表达载体pET-30a(+)-xyn11C。重组蛋白rXyn11C在E.coli BL21(DE3)中以可溶和包涵体两种形式表达，但可溶表达的蛋白量很低。因此对包涵体蛋白进行了Ni-亲和层析和透析复性，得到了电泳纯且具有很高木聚糖酶活性的重组蛋白rXyn11C。
rXyn11C专一地降解木聚糖底物，对山毛榉木木聚糖表现出最高的酶活力。以山毛榉木木聚糖为底物的Km值为4.030 mg/ml，Vmax值为0.533mmolmin-1mg-1;以桦木木聚糖为底物的Km值为3.403 mg/ml，Vmax值为0.276mmolmin-1mg-1。rXyn11C的最适作用pH为7.0，在45℃反应温度下活性最高，在pH10.0 Tris-HCl缓冲液中孵育30min，残留约50％活性，在45℃孵育30min残留约40％活性，50℃处理30min，酶基本完全失活。在1mM的浓度下，Zn2+、Mn2+、Ag+、Fe2+、Fe3+、Cr3+、Co2+、pb2+、SDS对酶活有明显的抑制作用;在10mM的浓度下，除Li+、K+之外，大部分测定的金属离子及化学试剂均能够对rXyn11C木聚糖酶活性产生不同程度的抑制，其中Cu2+、Fe3+、Hg2+离子能导致rXyn11C木聚糖酶活性的完全丧失;然而1mM和10mM的Tween20对酶活都具有明显的促进作用。薄层层析(TLC)发现，rXyn11C对山毛榉木木聚糖的降解产物为多种低聚寡糖。rXyn11C仅能够降解木四糖以上的寡糖，并产生高于底物聚合度的寡糖组分，同时显示出降解活性和糖基转移酶的合成活性。木三糖能促进rXyn11C对木四糖的糖基转移作用，这种促进作用随着作用时间的延长越加明显。
简单无机盐滤纸培养基是纤维堆囊菌分离纯化和培养保存的常规营养基质。本文研究了S.cellulosum So0157-2在简单无机盐加滤纸（结晶纤维素）之外的其他糖类物质作为唯一碳源进行生长的能力。结果显示出不同的利用能力，在以土豆淀粉、L-阿拉伯糖、糊精、葡萄糖、木聚糖等为唯一碳源时具有明显的生长趋势，而对木糖、羧甲基纤维素、壳聚糖等糖类物质的利用能力较弱。研究So0157-2以葡萄糖、木聚糖为唯一碳源的生长情况发现其在浓度为0.75％的CNST-G、CNST-X生长较好，在第1-2天达到最大生物量。
细胞组分的空间分布可以通过细胞组分的分级分离并进行检测的方法进行研究。本文选择复杂培养基M26以及简单培养基CNST-G和CNST-X培养So0157-2，收集浓缩培养液作为胞外游离组分，收集细胞并分离成膜组分和细胞内可溶组分。对胞外游离组分、膜组分和细胞内可溶组分进行酶活测定、酶谱分析和部分酶组分的western bolt检测。结果显示三种培养基来源的胞外游离组分、膜组分和细胞内可溶组分均具有可检测的木聚糖酶酶活和CMC酶活。膜组分的木聚糖酶活性占总木聚糖酶酶活的50％以上，可能在So0157-2利用木聚糖过程中起着重要作用。木聚糖酶酶谱分析发现胞外游离组分具有木聚糖酶活性，说明液体培养的So0157-2可能分泌木聚糖酶至细胞外，但M26，CNST-X培养的So0157-2胞外游离组分的木聚糖水解条带明显多于CNST-G;三种培养基培养的So0157-2的细胞内可溶组分的木聚糖酶酶谱都得到3条位置相同的水解条带，可能是相同木聚糖酶的作用结果;CNST-X培养的So0157-2膜组分的酶谱最上面一条水解带对应的蛋白大小大于230kDa，与M26和CNST-G培养的So0157-2的膜组分酶谱不同。这些差异可能与培养基中淀粉、木聚糖和葡萄糖对木聚糖酶的表达的诱导和阻遏作用有关。以CMC为底物的酶谱分析发现各个组分都能形成多条水解条带，对应着多种CMC酶，其蛋白大小主要分布在25kDa-100 kDa之间，不同培养基培养的So0157-2的组分的CMC酶酶谱有多处不同，表现在CMC酶的种类及相对含量上。利用抗-rXyn11A多克隆抗体进行的Western Blot在各组分中都杂交出多条条带。在Xyn11A的理论分子量的位置，3种细胞内可溶组分及CNST-G的胞外游离组分中有两条杂交条带。
细胞组分的细胞空间分布还可以采用细胞原位定位的方法。本文选取CNST-F平板培养的So0157-2细胞，用25％蔗糖质壁分离处理后，包埋、固定后制备了超薄切片。利用抗-rXyn11A多克隆抗体，通过免疫胶体金标记、透射电镜检测研究Xyn11A的细胞定位情况，建立了在纤维堆囊菌中进行蛋白细胞原位定位的操作体系。透射电镜结果显示，阴性对照E.coli BL21(DE3)-pET-22b细胞及细胞外面均匀分布少量非特异性结合金颗粒;阳性对照E.coli BL21(DE3)-pET-22b-xyn11A中包涵体表达的Xyn11A被标记后，形成块状分布的特异性结合金颗粒;So0157-2细胞的外膜、内膜上及周质中分布有少量金颗粒，大部分标记的金颗粒都存在细胞质内。