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研究背景:动脉粥样硬化(As)是一个多因素参与、多基因异常的疾病,以细胞内胆固醇平衡失调、胆固醇代谢障碍为特征。泡沫细胞的形成是As的核心环节。胆固醇代谢失衡贯穿于泡沫细胞形成的整个过程。B类I型清道夫受体(scavenger receptor class B type I,SR-BI)是细胞膜上的一种清道夫受体,在动脉硬化的发生发展过程中发挥了重要的生物学功能。SR-BI在肝脏中表达可促进HDL胆固醇酯的选择性摄取,由此被认为在逆向胆固醇转运中发挥重要作用。高密度脂蛋白(HDL)可通过多种机制发挥抗动脉粥样硬化作用。有研究显示:富含磷脂的HDL可以促进细胞胆固醇流出,减少在细胞内蓄积。而且重构高密度脂蛋白颗粒中磷脂分子的物理性质显著影响颗粒清除细胞游离胆固醇的能力。本研究意在探讨不同磷脂配比重构的脂蛋白对J774巨噬细胞胆固醇转运和SR-BI表达的影响。目的:研究不同磷脂配比构成的脂蛋白rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3、rHDL-B1、rHDL-B2对J774巨噬细胞胆固醇转运的影响;观察不同磷脂配比脂蛋白rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3以及不同浓度的rHDL-A3对J774巨噬细胞SR-BI表达的影响。方法:取新鲜抗凝血浆,用超速离心法进行密度梯度离心,收集LDL、HDL3。将LDL置于含10μmol/LCuSO4的PBS溶液(pH7.2)中,37℃温育24h;氧化修饰后的LDL置含200μmol/l EDTA的PBS中透析24h。将POPC、CE、Apo A-I、胆酸钠按不同比例混合反应生成脂蛋白,分别记为rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3、rHDL-B1、rHDL-B2。本实验分为三部分。第一部分,研究rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3、rHDL-B1、rHDL-B2、HDL3对J774巨噬细胞胆固醇转运有何影响。经oxLDL预处理24小时的J774巨噬细胞分别加入rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3、rHDL-B1、rHDL-B2、HDL3孵育16小时,用高效液相色谱分析法和液体闪烁计数法检测细胞胆固醇转运情况。第二部分,主要检测rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3对J774巨噬细胞SR-BI表达的影响:用逆转录聚合酶链反应检测SR-BI的转录表达,用Western Blotting检测SR-BI的蛋白表达。第三部分,主要检测不同浓度的rHDL-A3对J774巨噬细胞SR-BI表达的影响:用逆转录聚合酶链反应检测SR-BI的转录表达,用Western Blotting检测SR-BI的蛋白表达。结果:I.高效液相色谱分析细胞内胆固醇和胆固醇酯含量变化,oxLDL组、HDL3组、rHDL-A1组、rHDL-A2组、rHDL-A3组、rHDL-B1组、rHDL-B2组细胞内胆固醇酯与总胆固醇的比值分别为:49%,23%,39%,36%,32%,29%,24%(P<0.05)。说明用不同含量磷脂重构的脂蛋白处理oxLDL诱导过的J774巨噬细胞CE/TC比值随着磷脂含量的增加而减少;与oxLDL单独处理的对照组相比,HDL3处理组与重构脂蛋白处理组细胞CE/TC比值均有不同程度的降低,其中HDL3处理组最为明显。液体闪烁计数法检测J774巨噬细胞胆固醇流出情况:oxLDL对照组、HDL3组、rHDL-A1组、rHDL-A2组、rHDL-A3组、rHDL-B1组、rHDL-B2组,各组J774巨噬细胞胆固醇流出率分别为5.24%、26.59%、15.47%、18.66%、22.57%、20.36%、11.46%(P<0.05)。结果显示:随着rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3中磷脂成分比例的增加,细胞胆固醇流出率也逐渐增加。II.用RT-PCR和Western-Blotting方法检测SR-BI的mRNA及蛋白表达,结果显示:随着磷脂组分所占比例的增加,rHDL- A1、rHDL-A2、rHDL-A3对J774细胞SR-BI表达呈逐渐上调趋势;III用RT-PCR和Western-Blotting方法检测SR-B1的mRNA及蛋白表达,结果显示:rHDL-A3对J774细胞SR-BI表达呈浓度依赖性上调。总结:不同含量磷脂的脂蛋白处理oxLDL诱导过的J774巨噬细胞CE/TC比值随着磷脂含量的增加而减少;与氧化LDL对照组相比HDL3处理组与重构脂蛋白处理组细胞CE/TC比值均有不同程度的降低,其中HDL3处理组最为明显。随着rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3中磷脂成分比例的增加,细胞胆固醇流出率也逐渐增加,而且rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3对J774细胞SR-BI表达呈浓度依赖性上调趋势。结论:重构脂蛋白磷脂组分所占比例的增加促进J774巨噬细胞胆固醇流出增加,而且相同比例磷脂成分构成的脂蛋白随着CE组分比例的增加,细胞胆固醇流出则逐渐减少;重构脂蛋白磷脂组分所占比例的增加,使J774巨噬细胞SR-BI表达水平呈浓度依赖性上调。