蝰蛇(缅甸亚种)属于蝰亚科，是东南亚地区最常见的毒蛇种之一。蝰蛇毒主要表现为促凝活性，至今己从其中分离出多种促凝组分，如凝血因子X激活剂(RVV-X)、凝血因子V激活剂(RVV-V)等，而对其中纤维蛋白溶解组分的分离及性质研究报道较少。其纤溶组分的多少、纤溶生物活性特征未完全明了。本课题针对蝰蛇(缅甸亚种)粗毒初分后表现纤溶活性的组分进行了纯化，却发现分离终产物FⅥbb除可以直接溶解纤维蛋白原、纤维蛋白和酪蛋白外，还可以明显缩短血浆凝固时间，具有促凝活性。本实验即阐述了组分FVIbb的分离过程和部分生物活性特点。 一、组分FVIbb的分离纯化 蝰蛇(缅甸亚种)毒组分FVIbb经过三步分离程序得到。粗毒经CM-SephadexC-50阳离子交换层析得到12个蛋白峰，其中第2峰(FⅡ)和第6峰(FⅥ)具有较强的纤溶活性。FⅥ进一步经Sephadex G-150(超细)凝胶过滤层析得到5个蛋白峰，其中第2峰即FVIb具有纤溶活性；将其再经过Chelating Sepharose Fast Flow金属离子螯合亲和层析得到2个蛋白峰，其中第2峰(FVIbb)具有纤溶活性。最终回收率为4.24﹪。 FVIbb经SDS-PAGE电泳显示为单一条带，经质谱测得分子量为59138，经反相HPLC检测组分FVIbb纯度为94.98﹪。 二、FVIbb蛋白水解活力的测定 2．1 FVIbb的酪蛋白水解活性用水解Azo-Casein产生可溶于三氯乙酸的有色组分，使反应液的A390值升高的方法观察FVIbb的酪蛋白水解活性。Azo-Casein是蛋白水解酶的发色底物。 结果：FVIbb可水解Azo-Casein，且随着FVIbb浓度的升高，反应液的A390值逐渐增大，显示其蛋白水解活力逐渐增强。 2．2 FVIbb的纤维蛋白原溶解活性采用剩余可凝纤维蛋白原测定法，以FVIbb与纤维蛋白原共同温育不同时间后，剩余的可凝纤维蛋白原含量减少的程度来表示其纤维蛋白原溶解活性。结果：温育时间分别为1min、5min、15min、30min和60min时，剩余可凝纤维蛋白原量(﹪)依次为74.4﹪、65.2﹪、47.8﹪、37.8﹪和18.1﹪。显示随着时间的延续，FVIbb水解掉的纤维蛋白原逐渐增多。 2．3 FVIbb的纤维蛋白溶解活性采用纤维蛋白平板法，将不同浓度的FVIbb 20ul点样于纤维蛋白平板表面，以产生的透明溶解圈垂直两直径的乘积大小来表示纤溶活力。结果：FVlbb浓度分别为0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml和3mg/ml时，纤维蛋白溶解产生的透明溶解圈垂直两直径的乘积依次为18.46±1.93 mm<2>、52.06±7.15mm<2>、76.15±5.55mm<2>、105.69±15.26 mm<2>、124.82±4.9mm<2>、151.81± 3.06 mm<2>。显示FVIbb能溶解纤维蛋白且在一定浓度范围内其纤溶活性具有量效关系。 2．4温度、pH值、金属离子和酶抑制剂对FVIbb蛋白水解活性的影响在不同的温度、pH值和金属离子及抑制剂的环境中，FⅥbb水解Azo-Casein产生A390值的变化来考察环境对其活性的影响。结果显示：FVIbb的最适温度为40℃，最适pH为10.0；EDTA和DTT可显著抑制其活性，PMSF和抑肽酶对其活性没有影响；BE<2+>、Ca<2+>、Mg<2+>可增强FⅥbb的蛋白水解活性，而Zn<2+>、Ni<2+>和Cu<2+>可抑制其活性。表明FVIbb为金属蛋白酶，对热不稳定，在碱性条件下活性较好。 三、FVIbb降解纤维蛋白原及纤维蛋白活性的分析 3．1 FVlbb降解纤维蛋白原的作用 将0.5mg/ml的FVIbb加入纤维蛋白原溶液中温育，在不同时间点取样作SDS-PAGE。为考察。FVIbb降解纤维蛋白原的作用方式与人纤溶酶作用的异同，用同样方法以0.5U/ml的人纤溶酶(Sigma)作对照。结果显示：FVIbb对纤维蛋白原的Aα链、Bβ链和γ链均有水解作用，但敏感性不同。Aα链1min后即消失，Bβ链30min后消失，γ链则需作用24h以上才缓慢消失。纤溶酶迅速降解纤维蛋白原，在15 min以内纤维蛋白原的Aα链、Bβ链和γ链即完全降解。此外，FVIbb降解纤维蛋白原产生的水解片断的大小与纤溶酶裂解纤维蛋白原产生的片断大小不相同，说明二者的作用位点不同。 3．2 FVlbb降解纤维蛋白的作用 将FVlbb与间接溶纤的尿激酶(UK)共同作用于普通平板和加热平板，在加热平板中，残留在纤维蛋白原中的纤溶酶原因加热而失活，对照两平板可判断FVIbb溶解纤维蛋白的作用方式。结果：在普通平板上FVIbb和UK均可产生透明溶解圈；而在加热平板上FVIbb可产生同样大小的透明溶解圈，UK则不能溶解纤维蛋白。表明FVIbb不是通过激活纤溶酶原而发挥作用的，其溶纤作用是直接酶解纤维蛋白。 用凝血酶将纤维蛋白原变成纤维蛋白，再加入2 mg/ml的FVIbb共育，在不同时间点中止反应，并取样作SDS-PAGE。用同样方法以0.05U/ml的人纤溶酶(Sigma)0.15 ml作阳性对照。结果显示：FVIbb可水解纤维蛋白的α链、β链和γ-γ二聚体，但作用较人纤溶酶慢，共育8小时后才出现α链和γ-γ二聚体的少量水解，24小时后降解完全。FVIbb降解人纤维蛋白产生的片断与人纤溶酶产生的纤维蛋白降解产物(FDP)不同。 四、FVIbb的促凝作用 以血浆复钙时间(RT)的缩短来表示促凝活性。不同浓度的FVIbb与兔枸橼酸盐血浆混合，加入CaCl<,2>后记录抽出纤维蛋白细丝所需的时间即为血浆复钙时间。用同样方法比较FVIbb、蝰蛇粗毒和人凝血酶促凝活性的异同。结果：正常血浆复钙时间为149.5±2.38s。FVIbb浓度分别为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml和5mg/ml的血浆复钙时间依次为8.5±1s、11±1.15 s、7±2s、8.5±1s、8.5±1s。粗毒浓度分别为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml和5mg/ml的血浆复钙时间依次为9±1.15s、9.5±1s、16.5±1.9ls、18±2.3s、22.5±1.9ls。表明FVIbb和粗毒均具有促凝活性，但其促凝活性的大小不呈剂量依赖性。 五、FVIbb的类凝血酶活性测定 采用反应板法测定FVIbb的类凝血酶活性。待测酶液与纤维蛋白原溶液混合，记录抽出纤维蛋白细丝的时间。结果：2 mg/ml的FVIbb与纤维蛋白原混合不能形成纤维蛋白，且FVIbb与纤维蛋白原溶液混合10 min后再加入凝血酶也无纤维蛋白形成。显示FVIbb可溶解纤维蛋白原，没有类凝血酶活性。 六、FVIbb的等电聚焦电泳 FVIbb的等电聚焦电泳结果显示为两个极接近的条带，pI在4.8和4.9左右。表明FVIbb可能由两种分子量相同、等电点不同但极接近的异构体组成；也可能FVIbb是糖蛋白，由于糖基化修饰的不同形成多个等电点；亦或FVIbb纯化不够彻底。 小结： 1、蝰蛇(缅甸亚种)粗毒依次经过CM-Sephadex C-50阳离子交换层析、SephadexG-150(超细)凝胶过滤层析和Chelating Sepharose Fast Flow金属离子螯合亲和层析分离得到电泳纯的组分FVIbb，纯度)94.5﹪，分子量为59138。 2、组分FVIbb即可水解纤维蛋白原和纤维蛋白，又可水解酪蛋白。对纤维蛋白原的Aα链、Bβ链、γ链和纤维蛋白的α链、β链、γ-γ二聚体均有水解作用。 3、组分FVIbb可明显缩短贫血小板血浆复钙时间，促进贫血小板血浆凝固，但不具有类凝血酶活性，其促凝机制不清。 4、FVIbb为金属蛋白酶，分子中的金属离子和二硫键是其活性所必需的。