论文部分内容阅读
目的:观察血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)及其一型受体(angiotensinⅡtype 1 receptor,AT1R)抑制剂坎地沙坦(Candesartan)对卵巢癌Caov-3细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,探讨其与Ras同源基因/Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(Ras homologgene/Rho-associated coiled coil-forming protein kinase,Rho/ROCK)通路相关蛋白表达的关系。方法:1.体外培养人卵巢癌Caov-3细胞,采用不同浓度的外源性Ang II、Candesartan及Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶抑制剂Y-27632处理Caov-3细胞12 h、24 h、48 h,CCK-8法检测三种药物对Caov-3细胞存活率的影响;2.为进一步检测Candesartan对Caov-3细胞增殖的影响,流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)法检测Candesartan对细胞凋亡率的影响;3.划痕实验及Transwell小室侵袭实验检测Candesartan和Y-27632对外源性Ang II处理后的Caov-3细胞迁移及侵袭能力的影响;4.使用蛋白印迹实验检测对Caov-3细胞内Rho A、Rho C及ROCKⅠ蛋白表达水平的影响以及对ROCKⅠ蛋白下游底物肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)功能亚基(myosine phosphatae targeting subunit 1,MYPT1)的磷酸化水平的改变。结果:1.随着培养时间的延长,外源性Ang II各剂量组出现不同程度对卵巢癌Caov-3细胞增殖的促进作用(P<0.01),而Candesartan和Y-27632各剂量组出现不同程度对增殖的抑制作用(P<0.01);2.细胞凋亡实验显示,Caov-3细胞在使用Candesartan处理24h后加药组与对照组细胞凋亡率间的差异无统计学意义,P>0.05;3.划痕实验显示Candesartan组的相对迁移率为(30.9±3.18)%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),Transwell小室侵袭实验亦显示Candesartan抑制Caov-3细胞侵袭,其侵袭细胞数较对照组显著降低(P<0.01),且可以下调Rho A(71.04±6.96)%、Rho C(67.96±13.23)%及ROCKⅠ(59.06±16.30)%蛋白的表达和MYPT1的磷酸化水平(60.55±9.55)%,(P<0.01);4.划痕实验显示Y-27632组相对迁移率为(34.4±2.43)%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),Transwell小室侵袭实验亦显示Y-27632抑制Caov-3细胞侵袭,其侵袭细胞数较对照组显著降低(P<0.01),且可以下调Rho A(69.30±7.46)%(P<0.01)、Rho C(68.78±11.17)%(P<0.01)及ROCKⅠ(78.06±6.41)%(P<0.05)蛋白的表达和MYPT1的磷酸化水平(56.36±7.74)%(P<0.01);5.外源性Ang II对Caov-3细胞迁移无明显影响(P>0.05),但与对照组细胞穿膜数(265±40)相比Ang II组细胞穿膜数为(308±32)个,侵袭能力上升(P<0.05),且加入Candesartan和Y-27632后细胞穿膜数分别为(185±23)个和(116±22)个,较Ang II组明显降低(P<0.01)。另外外源性Ang II还可以增加Caov-3细胞内Rho A(112.87±1.50)%(而非Rho C)、ROCKⅠ(121.20±6.66)%蛋白的表达水平以及下游MYPT1(116.32±3.35)%的磷酸化水平(P值均小于0.05),在Ang II诱导下分别加入Candesartan和Y-27632可以抑制Rho A、ROCKⅠ蛋白的表达以及下游MYPT1的磷酸化(P<0.01)。结论:1.抑制Rho/ROCK通路可能可以下调Caov-3细胞的增殖、迁移及侵袭能力;2.拮抗AT1R活性可能通过抑制Rho/ROCK通路,引起Caov-3细胞的增殖、迁移及侵袭能力下降,但对引起细胞凋亡无明显影响;3.外源性Ang II结合AT1R,通过上调Rho A/ROCK通路,促进卵巢癌Caov-3细胞侵袭。