论文部分内容阅读
第一部分大鼠骨髓源性MSCs的分离、培养与鉴定目的:探讨一种可靠、纯度高的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外提取分离、纯化、培养和鉴定的方法。方法:通过密度梯度离心结合贴壁培养技术来分离、纯化与培养大鼠骨髓MSCs,同时对其生物学特质进行检测。针对细胞表面的标记分子通过细胞免疫化学以及流式细胞仪进行检测。结果:所培养的大鼠骨髓MSCs贴壁生长,大多为梭形;CD44于细胞表面高表达,极少见CD45表达,CD34则完全不表达。结论:试验将Percoll分离液梯度离心密度设定成1.073g/ml,同时借助贴壁纯化技术,提纯到较高纯度的骨髓MSCs。14d通过3代培养会扩增至107细胞数量级,符合心肌梗死细胞移植种子细胞的要求。第二部分超声破坏微泡介导G-CSF促进MSCs归巢大鼠缺血心肌的实验研究目的:观察超声微泡介导粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)对大鼠骨髓间充质干细胞归巢至大鼠心肌缺血区的效果。方法:将30只心肌梗死(MI)模型制备成功的wistar大鼠随机分为5组:A:空白对照组(C),B:单纯MSCs组(MSCs),C:超声微泡+MSCs组(US/MB+MSCs),D:超声微泡+G-CSF组(US/MB+G-CSF),E:超声微泡+G-CSF+MSCs组(US/MB+G-CSF+MSCs);心梗模型制成后第2天D组和E组给予G-CSF15ug/kg皮下注射,C、D、E组经尾静脉注入声诺维超声微泡溶液1ml(浓度约2×108个/ml),同时进行经胸诊断超声辐照,频率为5 MHz,机械指数(MI)1.3,辐照5s,间隔5s,共10min,第4天及第6天重复超声辐照微泡操作,共辐照3次,建模后第7天A组经尾静脉注入1ml生理盐水作为对照;B组C组和E组经尾静脉注入经4,6联眯-2-苯基吲哚(DAPI)标记的细胞悬液(1×107个细胞混悬于2 ml PBS中)于2 min内缓慢注入,移植后48h,将动物处死,切取心肌梗死边缘部位组织,对心肌缺血区域的MSCs分布状况借助激光共聚焦显微镜进行观察。结果:借助激光共聚焦显微镜,发现相比其它组,超声微泡+G-CSF+MSCs组MSCs明显偏高。结论:MSCs能归巢至大鼠心肌缺血区域,超声微泡介导G-CSF能够增强其归巢作用。第三部分超声微泡介导G-CSF联合MSCs移植治疗大鼠心肌梗死的实验研究目的:对超声微泡介导G-CSF联合MSCs移植治疗大鼠心肌梗死的可行性进行研究。方法:将30只MI模型制备成功的wistar大鼠随机分为5组:A:空白对照组(C),B:单纯MSCs组(MSCs),C:超声微泡+MSCs组(US/MB+MSCs),D:超声微泡+G-CSF组(US/MB+G-CSF),E:超声微泡+G-CSF+MSCs组(US/MB+G-CSF+MSCs)。心梗模型制成后第2天D组和E组给予G-CSF 15ug/kg皮下注射,C、D、E组经尾静脉注入声诺维超声微泡溶液1ml(浓度约2×108个/ml),同时经胸诊断超声辐照,频率为5 MHz,机械指数(MI)1.3,辐照5s,间隔5s,共10 min,第4天及第6天重复超声辐照微泡操作,共辐照3次,待完成建模第7d,A组经尾静脉注入1ml生理盐水作为对照;B组C组和E组经尾静脉注入细胞悬液(1×107个细胞混悬于2 ml PBS中)于2 min内缓慢注入。移植后经过28d,对大鼠心脏大小与左心功能进行超声心动图检测,借助免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色技术对CD34及VEGF表达水平进行检测,计数微血管密度(Microvessel density,MVD);借助Westernblot与ELISA对VEGF蛋白表达水平进行检测。结果:超声心动图显示超声微泡+G-CSF+MSCs组、超声微泡+MSCs组和超声微泡+G-CSF的心功能均有明显改善,CD34的表达及微血管密度和VEGF蛋白的表达也高于其他组,超声微泡+G-CSF+MSCs组最高,差异有统计学意义(P<0.05)。超声微泡+MSCs组和超声微泡+G-CSF组间比较差异无显著性。结论:超声破坏微泡介导G-CSF联合MSCs移植可通过促进心肌血管新生来治疗心肌梗死,改善心功能。