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枳实为传统中药,含有极为丰富的黄酮(5%-28%),包括芸香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷等。现代药理研究表明枳实黄酮具有抗病毒、镇静、镇痛、抗氧化等药理作用,但其提取方法主要限于传统有机溶剂提取。关于新技术新方法的应用研究报道较少,目前大多停留在实验室探索阶段。此外,枳实黄酮对化疗腹泻的治疗作用尚无文献报道。故本文研究了枳实黄酮的超声辅助低共熔溶剂提取及其对化疗腹泻的治疗作用,主要研究内容及结果如下:方法:1、枳实黄酮的超声低共熔溶剂提取首先制备了16种低共熔溶剂,包括氯化胆碱/蔗糖、氯化胆碱/木糖醇、氯化胆碱/脯氨酸、氯化胆碱/柠檬酸、氯化胆碱/葡萄糖、氯化胆碱/苹果酸、氯化胆碱/醋酸、氯化胆碱/乳酸、乙酸钠/乳酸、乙酸铵/乳酸、氯化胆碱/乙二醇、氯化胆碱/1,2-丙二醇、氯化胆碱/1,6-己二醇、氯化胆碱/1,4-丁二醇、氯化胆碱/1,3-丁二醇、氯化胆碱/丙三醇,随后对16种低共熔溶剂进行初步筛选,确定最适合的溶剂,并对最适低共熔溶剂组分比例进行筛选,得到最适提取溶剂。以提取得率为指标,对最适溶剂进行提取时间、提取温度和超声功率进行单因素考察,在单因素实验的基础上用BBD响应面法进行提取工艺的优化。大孔吸附树脂富集分离枳实黄酮并回收氯化胆碱/醋酸。2、枳实黄酮对化疗腹泻小鼠的治疗作用腹腔注射5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导小鼠化疗腹泻模型。雄性昆明小鼠60只,随机分为6组:正常对照组(C)、模型组(M)、枳实黄酮(50、100、200 mg/kg,AFIF.L、AFIF.M、AFIF.H)和洛哌丁胺组(0.3 mg/kg,LHC)。在实验的头5天,M、AFIF.L、AFIF.M、AFIF.H和LHC组腹腔注射5-FU(50 mg/kg),每天一次,正常组腹腔注射等体积生理盐水。从第6天开始各治疗组分别灌胃给予设计剂量的药物,每天一次,连续7天,C组和M组同等方式给予等体积生理盐水。实验期间,每天观察小鼠的状态、活动情况、粪便状态以及记录体重、采食和饮水。对每天腹泻状态进行评分并记录。实验结束后,解剖小鼠,测量结肠长度。结肠组织切片,用H&E(Hematoxylin and Eosin)染色后进行病理观察。利用试剂盒检测小鼠结肠组织中氧化应激参数及炎症细胞因子水平,采用二代测序的方法检测小鼠的肠道菌群。结果:1、超声波辅助低共熔溶剂提取枳实黄酮经初步筛选发现氯化胆碱/醋酸为最适提取溶剂,进一步实验发现氯化胆碱和醋酸的最佳比例为1:2,最佳单因素实验结果为提取温度60℃,提取时间80 min,超声功率80 W;BBD响应面实验优化结果为提取温度42℃、提取时间82 min、超声功率90 W,在此优化的条件下,芸香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷的百分含量分别为3.36%、0.629%、15.96%,提取效果显著优于传统有机溶剂乙醇。利用HPD-722、HPD-826、AB-8、D-101、NKA-9、X-5七种型号的大孔吸附树脂直接吸附分离低共熔溶剂提取液中的三种黄酮类成分,其中D-101型号树脂总体回收率最高,经D-101型号大孔吸附树脂处理后,芸香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷三种黄酮类成分的回收率分别为83.59%、73.41%、83.43%。回收后的低共熔溶剂对枳实黄酮进行二次提取,枳实总黄酮回收率可达到81.21%。2、枳实黄酮对5-FU诱导的小鼠腹泻的影响正常小鼠连续5天腹腔注射5-FU(50 mg/kg),出现肠粘膜炎症状,如腹泻、体重减轻、饮食量减小、饮水增加,自主活动减少。通过枳实总黄酮(50,100,200 mg/kg)连续治疗7天有效缓解由5-FU引起的腹泻、体重减轻等症状。结肠的形态学和病理学分析结果进一步证实了枳实总黄酮的疗效。同时,通过枳实总黄酮治疗也改善了5-FU所致的氧化应激和炎性细胞因子的变化。5-FU通过减少物种的丰富度和多样性干扰了肠道菌群的整体结构,而100 mg/kg的枳实总黄酮溶液处理显著恢复了物种的丰富度和多样性,进一步发现,枳实黄酮抑制了病原菌的生长,促进了有益微生物的繁殖。结论:氯化胆碱-醋酸低共熔剂易制备、对枳实黄酮有极好的提取效果,是一种值得深度开发的绿色提取溶剂。由于我们的实验规模和次数有限,还有很多关键问题,如低共熔剂的循环利用等还需进一步深入研究。本研究还证实了枳实黄酮有效改善5-FU引起的肠道损伤,说明其对化疗引起的肠毒性有潜在的治疗作用。这种治疗作用与抑制氧化应激和调节肠道微生物菌群有关。