背景与目的在中国,癌症所带来的健康负担逐年增长,每年大约有超过160万人被诊断出癌症,每年大约有120万人因癌症而死亡。乳腺癌在中国女性恶性肿瘤中发病率跃居第一,死亡率稳居第二。在癌症患者的循环血液中往往能够检测出升高的血浆游离DNA。核酸可以通过多种病理性和生理性方式释放出来,比如从活的细胞或者死亡细胞中主动或者被动的释放出来,在一系列诸如血液、脑脊液、唾液、粪便和尿液等等其他细胞外基质中均可能检测出血浆游离DNA。细胞凋亡过程产生的大约180 bp长度的片段DNA是基因组DNA程序性消化的结果。循环肿瘤DNA可以在一系列各种各样的实体恶性肿瘤中检测得到并且循环肿瘤DNA的浓度水平会随着肿瘤分期的升高而升高。相对于作为背景的正常血浆游离DNA来说,肿瘤特异性DNA浓度显得较小,因此,针对循环肿瘤DNA的分析显得尤为富有挑战性,并且需要高灵敏度的检测技术方法。21三体综合征(又称唐氏综合征),是临床上最常见的新生儿染色体畸变所致疾病,每800个新生胎儿就可能有一个唐氏综合征胎儿的发生。18三体综合征(又称爱德华兹综合征)和13三体综合征(又称帕特氏综合征)是临床上除了21三体综合征以外最常见、最重要的胎儿染色体异常畸形病变。每6,000个新生胎儿就可能有一个18三体综合征,每10,000个新生儿大约有一个帕特氏综合征胎儿的出生。这些常见胎儿染色体异常畸形病变的检测是产前诊断的一个极其重要的部分,诸如经羊膜穿刺术、绒毛膜绒毛取样等传统意义上获取胎儿基因样本的产前检测技术方法均为侵入性的、有创性的,可能会给新生胎儿带来一定的风险。除了以上提及的有创性操作,诸如超声波扫描和母体血清标记物等无创产前诊断的方式对于鉴别诊断胎儿染色体非整倍体等高危孕产妇病例是很有用的,但其敏感性和特异性及其有限的。自从1977年血浆游离胎儿DNA在母体血浆中被检测出来,这血浆游离胎儿DNA备受关注并且为无创产前检测开启了多种多样新颖的检测方式,和侵入性、有创性产前检测相比,减少了诸如流产等复杂并发症所带来的危险性。针对孕妇血浆循环胎儿DNA的大规模并行测序近年来大大的改变了对常见胎儿染色体非整倍体(整体染色体的非正常数目)产前筛查的临床模式,是检测胎儿21、18、13三体的常见无创产前检测方法。采用这类无创产前检测技术,对胎儿21三体和18三体的检测敏感性平均高达99%和96%,特异性高达99%至100%。虽然目前许多专业协会均推荐高危孕妇进行无创产前检测,但是纵使无创产前检测实行得再好,也只是进一步的产前筛查,并不能作为诊断试验。仍有部分案例的无创产前检测结果与胎儿核型并不一致,原因在于孕妇血浆游离DNA是胎盘的(通常直接用做胎儿的)和母体的DNA混合物。胎儿血浆游离DNA是存在于母亲来源的总的DNA这个大背景中的,任何总体DNA(包括胎儿DNA和母体DNA)含量的增加都可能会在孕妇血浆总DNA的贡献中将目的染色体的浓度稀释掉。然而,循环DNA并不局限于孕妇血浆中,在肿瘤病人的血浆中常常同样能检测到升高的血浆游离DNA。每1000个孕产妇大约只有1个在妊娠期被诊断出癌症,这种情况相对是不常见的。在无创产前检测结果和胎儿核型不一致的孕妇中,一部分能继而被诊断出之前未被发现的恶性肿瘤。在孕妇中,最常见的恶性肿瘤主要有乳腺癌、宫颈癌,霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤,恶性黑色素瘤,白血病,卵巢癌和结直肠癌等等。但是,循环肿瘤DNA对无创产前检测结果的影响程度至今仍是不明确的。材料和方法该研究纳入2015年5月至7月期间在中国广东省广州市南方医科大学南方医院诊断出乳腺肿瘤的36例术前女性患者。南方医院伦理委员会的机构审查委员会准予该研究。所有参与者均在参与本研究前均签署得到伦理委员会认可的知情同意书。中国广东省广州市达瑞生物技术股份有限公司提供21、18、13三体流产组织样本。样本经比较基因组杂交确定核型。从组织样本中提取基因组DNA继而应用Covaris S2超声波(Covaris, Woburn, MA, USA)处理器打断。用Agencourt XP磁珠纯化打断后的140-200 bp的片段DNA,最后用Qubit 3.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)定量并记录。该研究共纳入2015年5月至9月期间经生物化学和超声筛选被诊断出胎儿非整倍体高危并且在广州达瑞生物技术股份有限公司进行无创产前检测的孕妇1252例。同时征募了99例未孕健康女性作为阴性对照人群。本研究纳入2015年5月至7月期间在中国广东省广州市南方医科大学南方医院诊断出乳腺肿瘤的36例术前患者。所有病例都经过活检术后病理确诊乳腺良性或恶性肿瘤。用EDTA抽血管抽取5-10 ml外周静脉血样本,在24小时内分离血浆,48小时内提取出DNA。抽取5 ml未孕健康女性外周血。所有血样本均在24小时内通过1,600×g 4℃低温离心10分钟后将上1层血浆转入新的离心管,再16,000×g离心15分钟后去掉残余血细胞,将上层血浆转移到新的离心管后,置于-20℃中备用。根据使用手册应用一常用的血浆游离DNA提取试剂盒(GenMag Circulating DNA from Plasma Kit, GenMag Biotech, Beijing, China)从700μl血浆中提取DNA,继而用Qubit 3.0定量后置于-20℃冷藏中备用。在未孕健康女性血浆游离DNA样本中分别加入10%的21、18、13三体胎儿DNA建立阳性参照样本。将乳腺肿瘤女性的血浆游离DNA分成4份(每份均从700μl血浆中提取获得),分别加入13%的21、18、13三体胎儿DNA建立试验样本。应用Ion Plus Fragment Library Kit将DNA样本和我们混合的DNA混合物依据调整后的Ion Xpress基因组DNA片段文库构建(Life Technology)使用指南分别构建文库。简单来说,应用一系列酶和聚核苷酸连接酶将DNA片段两断端进行末端修复,其中一端包括了一段有效连接barcode标记物的DNA链。引物酶混合物用于10个循环的聚合酶链反应。各种不同溶度的AMPure XP磁珠用于文库构建各个步骤的纯化(包括末端修复,接头连接和扩增)。继而,文库样本利用Ion OneTouch 2系统通过乳化聚合酶链反应进行聚集和扩增,用以自动形成Ion Sphere particles (ISP)模板产物。根据使用手册将阳性ISP模板应用Ion OneTouch富集并立即置于Ion半导体芯片上用Ion Proton sequencer 300个flows测序。总而言之,在本研究中,我们用标准的无创产前检测方法检测36例患有乳腺肿瘤的未孕患者的血浆。这些样本继而与21、18、13三体胎儿DNA血浆样本相混合以探索在患有良性或恶性乳腺肿瘤的孕妇中母体肿瘤对无创产前检测结果的影响程度。结果本研究纳入了36例乳腺肿瘤患者、99例未孕女性和1252例健康孕妇。孕妇血浆游离DNA的平均浓度是6.76 ng,乳腺肿瘤患者血浆游离DNA的平均浓度是6.44 ng,未孕健康女性的血浆游离DNA的平均浓度是4.18 ng。和健康的未孕女性相比,孕妇以及乳腺肿瘤患者的血浆游离DNA浓度较高,差异有显著性统计学意义(P<0.05)。相反,孕妇血浆游离DNA浓度和乳腺肿瘤患者血浆游离DNA相比,差异无统计学意义(P=0.277)。针对36例乳腺肿瘤患者的无创产前检测结果分析中,在其中两例患者的血浆游离DNA样本中检测出多个染色体异常,尤其是8号染色体。在样本17和样本32中,8号染色体的z值明显高于其他变异的染色体(占比5.56%)。在这两例乳腺肿瘤患者的血浆游离DNA样本17和样本32中,13号染色体的z值分别是4.09和10.19,18号染色体的z值分别是5.26和3.72,21号染色体的z值分别是8.61和3.72,表明基因组拷贝数变异的发生。有趣的是,这两例无创产前检测结果显示非整倍体阳性患者均在肿物完全切除前病理确诊为乳腺浸润性癌,且均为三阴性患者,即免疫组织化学显示ER、PR、HER-2均为阴性。模拟患有乳腺肿瘤的孕妇(乳腺肿瘤患者血浆游离DNA+13%的21、18、13三体胎儿DNA)其13号染色体的平均z值和标准差是20.10±11.51,18号染色体的平均z值和标准差是15.35±7.32,21号染色体的平均z值和标准差是11.22±5.58,而模拟阳性参照孕妇(健康女性血浆游离DNA+10%的21、18、13三体胎儿DNA)的13号染色体的平均z值和标准差是15.03±2.60,18号染色体的平均z值和标准差是13.70±1.36,21号染色体的平均z值和标准差是11.70±1.71。模拟患有乳腺肿瘤的孕妇其无创产前检测结果z值的标准差明显高于模拟阳性参照孕妇的标准差。理论上来说,由于模拟患有乳腺肿瘤的孕妇其加入的胎儿三体DNA较模拟阳性参照孕妇高(13%VS 10%),无创产前检测结果z值也应当较高,然而,模拟患有乳腺肿瘤的孕妇其21号染色体的z值(11.22)较模拟阳性参照孕妇低(11.70)。这种效果很可能是由于高浓度的循环肿瘤DNA超过了正常背景的母体血浆游离DNA水平,进而限制了血浆游离胎儿DNA的检测。的确,和对照组相比较,模拟患有乳腺肿瘤的孕妇其13号染色体和18号染色体的z值明显降低。在对36例144个样本(36*4)无创产前检测结果的评估分析中发现,有6个样本的绝对z值落在接近3的模拟两可的阈值中(3例13三体,3例18三体样本)。此外,有2个21三体的样本出现假阴性结果。结论总而言之,目前的实验数据第一次表明循环肿瘤DNA能够从以下两个方面影响无创产前检测的结果。首先,由于肿瘤DNA基因组拷贝数变异的检出,循环肿瘤DNA导致假阳性结果。相反,循环肿瘤DNA通过降低血浆循环胎儿DNA的比例来增加假阴性结果的可能性。以上结果强调了现有检测方法的重要局限性并可能有助于提高无创产前检测的检出率和可靠性。