论文部分内容阅读
牛结核病(Bovine-tuberculosis)是由牛结核分枝杆菌(Mycobacterium boris)引起的一种慢性、消耗性人兽共患传染病。牛结核的致病机理主要与牛分枝杆菌在肺泡巨噬细胞中的存活/侵入能力有关，牛结核分枝杆菌侵入巨噬细胞的机制，主要是由哺乳动物细胞侵袭蛋白(Mammalian cell-entryproteins，Mce)介导的，在牛分枝杆菌的致病机理中具有重要的作用。为了阐明牛结核分枝杆菌侵入宿主细胞和在肺泡巨噬细胞长期存活的机理，本研究利用基因重组技术表达牛结核分枝杆菌Mce4A和Mce4E蛋白，并对这两个蛋白进行纯化、复性，在体外获得Mce4A和Mce4E蛋白，并对两种蛋白与牛肺泡巨噬细胞的相互作用进行了研究，研究内容如下：
1.以牛结核分枝杆菌的DNA为模板，通过PCR的方法扩增克隆Mce4A和Mce4E基因，将所扩增基因克隆于原核表达载体pET30a(+)并进行测序，结果显示，Mce4A和Mce4E基因与GenBank上所公布的牛结核分枝杆菌和人分枝杆菌Mce4A和Mce4E基因同源性为100％。将重组表达载体转入宿主菌BL21进行诱导表达，表达蛋白经SDS-PAGE分析和Western-blot免疫印迹鉴定，结果证明MceAA蛋白和MceAE蛋白获得高效表达，表达量分别占菌体总量的52％和53.3％，分子量大小分别为43kDa和45kDa左右；利用Ni-NTA琼脂糖柱对表达蛋白进行纯化，纯化率大于90％；
2.重组Mce4E蛋白质能够与兔抗牛结核分枝杆菌阳性血清产生特异性反应，说明重组蛋白具有牛分枝杆菌的抗原性，为进一步研究牛结核分枝杆菌快速诊断试剂盒和研究亚单位疫苗奠定了基础。
3.纯化的蛋白经过透析复性、圆二色谱(CD)测定，结果表明，Mce4A蛋白和Mce4E蛋白均为典型的α螺旋型结构，经Jascow32软件分析计算，Mce4A蛋白α螺旋含量为31.1％，β-折叠含量为0％，无规卷曲含量为61.0％，转角含量为7.9％；Mce4E蛋白含有39.1％的α螺旋，60.9％的无规卷曲，无β-折叠和转角，为进一步开展牛结核分枝杆菌致病机理的研究和寻找新的药物作用靶位点奠定了基础。
4.用不同浓度的重组Mce4A蛋白和Mce4E蛋白刺激肺泡巨噬细胞，MTT检测分析表明，两种蛋白对牛肺泡巨噬细胞的活性有显著的抑制作用(P<0.05)；用细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒检测，结果表明，两种蛋白均不能引起肺泡巨噬细胞的凋亡。
5.用Mc04A蛋白、Mce4E蛋白、MtbPPD、MbPPD、BCG和ConA分别刺激肺泡巨噬细胞48h后，Real-time PCR方法检测结果显示，Mce4A蛋白和Mce4E蛋白都能够促使牛肺泡巨噬细胞TNF-α和IL-6 mRNA的表达上调(P<0.05)，而对IL-12表达没有影响(P>0.05)。Mce4E蛋白抑制肺泡巨噬细胞fNOS的mRNA表达(P<0.05)，相反，Mce4A蛋白促使肺泡巨噬细胞fNOS的mRNA表达上调。Mce4A蛋白和Mce4E蛋白能够促使肺泡巨噬细胞分泌炎性细胞因子，并对肺泡巨噬细胞的活性有抑制作用，证实两种蛋白在宿主细胞免疫应答反应中具有重要的作用。