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研究背景:骨肉瘤是发源于间充质干细胞的恶性肿瘤。骨肉瘤的发病年龄呈现双峰分布,常发病于青少年或老年人。由于大多数的骨肉瘤患者在诊断时时就有转移或微转移性,故几乎所有患者在手术切除的之前或之后都会接受多种药物联合化疗。患者往往耐受度较差,且复发几率较高。人参是一种原产于东北亚的草本植物,在东亚地区的传统医学中有着广泛的应用。作为人参中主要的活性物质之一,人参皂苷Rg3的抗肿瘤作用在近年来越来越引起人们的重视。人参皂苷Rg3的甾体结构使得它可以与细胞膜、膜结合离子通道、以及胞内和胞外的受体相互作用来改变细胞的转录水平以来发挥抗肿瘤作用。研究方法:本实验应用MTT实验、流式细胞术、细胞划痕实验、Transwell细胞侵袭实验检测了人参皂苷Rg3对骨肉瘤细胞系MG-63、HOS和U2OS增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响和对细胞周期作用。我们又进一步选择MG-63细胞作为研究对象,应用western blot、定量PCR、流式细胞术、小干扰RNA等实验手段进一步探究人参皂苷Rg3诱导细胞自噬、凋亡以及细胞周期阻滞的具体作用机制。实验结果:MTT实验发现人参皂苷Rg3以剂量依赖的方式抑制三种骨肉瘤细胞系MG-63、HOS以及U2OS的增殖。流式细胞术则验证人参皂苷Rg3的促三种肉瘤细胞系的凋亡。细胞划痕实验和Transwell细胞侵袭实验验证了人参皂苷Rg3可以抑制三种骨肉瘤细胞系的迁移和侵袭。WB实验发现经人参皂苷Rg3处理的的骨肉瘤细胞MG-63中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平与未加药的对照组相比有显著性地升高。Western blot和定量PCR证实人参皂苷Rg3组caspase-3的基因和蛋白表达水平增加,流式细胞术证实人参皂苷Rg3组细胞凋亡水平升高。而当我们使用代表性自噬通路抑制剂3-MA和人参皂苷Rg3同时作用于MG-63细胞时,WB实验和定量PCR显示3-MA可以显著逆转由人参皂苷Rg3导致的细胞凋亡和自噬相关蛋白的转录和表达水平的变化。而用小干扰RNA技术沉默LC3基因可以显著逆转人参皂苷Rg3导致的MG-63细胞的凋亡和迁移侵袭受限。WB实验显示人参皂苷Rg3可以使p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTORC1/mTORC1表达水平降低,而LC3/β-actin的表达水平增高,而加入PI3K激动剂IGF-1则可以逆转人参皂苷Rg3导致的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTORC1/mTORC1和LC3/β-actin表达水平的变化。流式细胞术检验经人参皂苷Rg3处理的骨肉瘤细胞系MG-63、HOS、U2OS处于G0/G1的细胞的比例上升,处于S期的细胞比例下降。WB实验结果显示人参皂苷Rg3处理的MG-63细胞中cyclinA、cyclinB的表达未见明显改变,而cyclinD1、CDK-4以及CDK-6的表达量显著下降,上游调节因子p53、p21的表达量显著上升。用小干扰RNA技术沉默p53基因可以显著逆转人参皂苷Rg3导致的周期阻滞作用和p21、cyclinD1、CDK4、CDK6表达水平的变化。实验结论:人参皂苷Rg3通过抑制PI3K/Akt/mTORC1,降低自噬抑制因子mTORC1的表达,引发细胞的自噬,LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平的增高,继而引起凋亡基因caspase-3转录和表达水平的升高并最终导致MG-63细胞的凋亡。同时,人参皂苷Rg3可以通过激活p53/p21来抑制G1期向S期转化的关键性蛋白cyclinD1和CDK-4、CDK-6的表达和活性使骨肉瘤细胞阻滞于G0/G1期。