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PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是至今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌因子,在细胞的生长、增殖、分化、凋亡、黏附、迁移和血管生长中发挥重要作用。现已证实该基因的突变、失活与乳腺癌、肺癌、肾癌等多种肿瘤的发生、发展密切相关,是目前肿瘤相关蛋白研究的热点之一。PTEN发挥肿瘤抑制功能的经典途径是细胞质中的PTEN通过其磷酸酶活性对PI3K/Akt、FAK、MAPK等信号通路的负性调控,调节细胞周期进程,诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞的增值、迁移。最近的研究进展表明,PTEN可以在胞质、胞核间穿梭,胞核中的PTEN可通过诱导细胞周期阻滞和维持染色体完整性发挥肿瘤抑制作用。目前,对PTEN的研究集中在PTEN的基因突变、蛋白表达的变化以及PTEN对其下游细胞信号转导网络的影响,而对PTEN蛋白翻译后调控,特别是其自身多聚化的作用及调控机制研究较少;细胞内调节PTEN蛋白细胞核-细胞质迁移的分子机制尚不十分清楚。
本实验室前期研究中发现PTEN抗体能够识别分子量约为PTEN两倍的蛋白,后于Cos-7细胞裂解液中进行非变性Western时发现同样的现象,我们推测此蛋白可能是PTEN的二聚体。通过采用GST-pulldown和免疫共沉淀技术以及荧光共振能量转移的方法,基本证实了我们的猜测,确定此蛋白是PTEN的同源二聚体而不是异源二聚体。进一步研究介导PTEN二聚体形成的主要结构域与功能键。已知PTEN的主要结构域包括:N端磷酸酶结构域,包含7~185位氨基酸残基;C2结构域,由186~353位氨基酸残基组成;由50个氨基酸构成的C末端尾部。在本研究中,我们采用上述相同技术,进一步发现C2结构域介导了PTEN同源二聚体的形成。由于半胱氨酸在蛋白质的空间结构形成中具有重要作用,而C2结构域中一共存在5个半胱氨酸残基(Cys211、Cys218、Cys250、Cys296和Cys304),为了阐释C2结构域的半胱氨酸残基是否影响PTEN二聚体的形成以及具体是哪一个半胱氨酸残基发挥主要作用,我们分别构建了上述五个半胱氨酸残基的突变体,将其突变为与之疏水性类似的丝氨酸。接着我们探讨了相关突变对PTEN二聚体形成的影响。先后用了非变性Western Blot、GST-pull down、质核分离以及免疫荧光的方法,发现218位半胱氨酸参与了PTEN二聚体的形成,该位点的突变促使PTEN由二聚体向单体转变,同时亦促进了PTEN向细胞核内的转移。
上述研究表明,PTEN同源聚合状态影响PTEN的核、质分布。而我们前期研究发现细胞的氧化还原状态影响PTEN二聚体的形成。H2O2和低氧处理是调节细胞氧化还原状态的主要手段,因此,接下来我们研究H2O2处理对PTEN二聚体形成,低氧条件对PTEN的核、质分布以及下游信号通路活化的影响,研究发现:
1)H2O2处理使PTEN由二聚体向单体转变;
2)P53随着H2O2浓度的增加呈现先升高后降低的趋势;
2)H2O2和低氧处理促进了PTEN向细胞核内的转移;
3)磷酸化PTEN、Akt和FAK随着低氧时间的延长呈现先升高后降低的趋势;
综上所述,本实验结果表明,PTEN具有同源二聚体形式,主要由PTEN-C2(186~353氨基酸残基)的半胱氨酸218位介导形成,PTEN的同源聚合可能是细胞调节PTEN蛋白细胞核-质迁移的分子基础。H2O2以及半胱氨酸218的突变通过干扰PTEN二聚体的形成促使PTEN在核内聚集,提示PTEN可能主要以单体形式进核。在功能方面,我们发现PTEN以二聚体形式负调控PI3K/Akt和FAK信号通路从而调节细胞的增殖和迁移等生理活动。