研究背景：疼痛是一种不愉快的情绪反应和病理过程,是临床最常见的症状之一。炎症性疼痛是由炎症反应所介导的一组以疼痛为主要特征的病理变化,在临床中较为多见,许多疾病均可产生炎症性疼痛,如骨关节炎、类风湿性关节炎以及牙周炎等。在这类疾病的治疗方面,非甾体抗炎药是缓解疼痛的一线用药,此外,还有激素类和中枢镇痛药等。然而,这类药物所导致的多种较严重的不良反应问题制约着它们在临床中的广泛应用,因此,有效且不良反应小的新型镇痛药亟待开发。鼠妇(Armadillidium vulgare Latreille),又名潮虫,是卷甲虫科动物卷甲虫的干燥虫体,其药用记载最早见于《神农本草经》,具有利水,通经,化瘀,止痛等功效。鼠妇是我国古代及民间常用的虫类药材,其资源丰富、药用历史悠久,对多种疼痛、炎症以及皮肤病等病症均有较好的治疗作用。根据近年来的临床观察及相关研究,鼠妇在缓解癌痛以及术后疼痛等方面疗效确切,不良反应小,是镇痛新药开发的潜在资源。然而,虫类药在中药现代化进程中处于较为初级的阶段,其研究规模及开发程度较为滞后,而专属性质量控制方法的欠缺是制约虫类药开发的重要原因之一。作为我国民间的习用药材,鼠妇在药效学、物质基础方面的研究较为薄弱,尚未有专属性的质量控制方法和检测指标,在一定程度上制约了鼠妇的药用开发及临床应用。研究目的：本课题对鼠妇镇痛、抗炎的药效学开展系统性研究工作并对其物质基础进行深入探索,为鼠妇的古代及现代应用提供科学依据。在此基础上,本课题对该虫类药的质量控制开展研究工作,建立质量控制方法,促进鼠妇的药用开发。实验方法：1.鼠妇有效部位的筛选本实验选用石油醚、乙酸乙酯、50%乙醇、100%乙醇以及纯化水等多种不同极性的溶剂提取鼠妇药材。采用醋酸扭体实验考察鼠妇不同提取物在相同给药剂量下的镇痛作用。动物灌胃给药1h后于小鼠腹腔注射冰醋酸,阳性对照药选择吲哚美辛,模型组灌胃生理盐水,计数小鼠在造模后20 min内的扭体次数。在此基础上,本实验采用HPLC-ELSD技术对上述鼠妇不同极性的提取物进行色谱分析。2.急性毒性实验小鼠灌胃鼠妇提取物(2.0、2.7、3.7、5.0 g/kg),观察动物在14天内的异常反应、毒性反应以及死亡率,测定其半数致死量。3.鼠妇镇痛研究依次采用醋酸扭体法、福尔马林法、热板法等疼痛模型验证并考察鼠妇提取物在3个给药剂量下(0.4 g/kg、0.6 g/kg、0.8 g/kg)的镇痛作用。3.1.醋酸扭体实验本实验以吲哚美辛为阳性药,其余实验操作及方法同上所述。3.2.福尔马林实验本实验以吲哚美辛和曲马多作为阳性药,动物给药处理后,于小鼠后足注射福尔马林溶液,以小鼠造模后的舔足时间为指标,分别计时各实验动物在前后两个致痛阶段(0-5 min以及15-30 min)的舔足时间。3.3.热板实验热板法以曲马多作为阳性药,以小鼠对热刺激的耐受潜伏期作为指标,测定动物在造模2h内不同时间点对热板的耐受时间,筛选潜伏期在5-15 s的小鼠进行实验并设置停止时间设为30s。4.鼠妇抗炎研究参照上述动物分组及处理方法,以炎症反应中炎性渗出环节为研究对象,采用多种炎症模型及实验考察鼠妇提取物的抗炎作用。4.1.角叉菜胶实验在本实验中,阳性药选择吲哚美辛,小鼠灌胃给药处理1h后于后足注射致炎剂角叉菜胶,测定动物在造模后6h内不同时间点的后足水肿程度,以肿胀度表示(E%)。4.2.醋酸致毛细血管壁通透性升高实验采取与上述醋酸扭体实验相同的造模方法及参数。小鼠于尾静脉注射0.5%伊文思蓝染液,随后腹腔注射冰醋酸,20 min后,处死小鼠,淋洗腹腔并收集腹腔液,以腹腔液中伊文思蓝的吸光度作为检测指标考察鼠妇对毛细血管壁通透性的影响,阳性药选择吲哚美辛。4.3.硫酸葡聚糖以及化合物48/80致炎实验分别采用硫酸葡聚糖以及化合物48/80两种不同致炎剂开展足肿胀实验,阳性药选择赛庚啶,其余操作参照角叉菜胶实验,分别测定动物在造模后4h和2h内的足肿胀程度。4.4.检测模型动物外周血中组胺的含量本实验参照化合物48/80实验的操作方法,阳性药选用地塞米松,小鼠造模0.5 h后,摘眼球取血并分离血清,采用ELISA检测方法测定血清中组胺的含量。5.鼠妇对炎细胞浸润的影响本课题采用小鼠腹膜炎模型,以腹腔注射致炎剂角叉菜胶造模,动物随机分成5组,即空白组、模型组、阳性组、鼠妇药物组(0.6g/kg,0.8g/kg),采用与前述相同的给药途径和时间,阳性药选择吲哚美辛,造模4h后处死小鼠,用相同体积PBS(含肝素)淋洗腹腔,收集腹腔液,检测小鼠腹腔液中白细胞数量,并采用酶联免疫吸附检测技术测定腹腔液中MPO活性以及TNF-α、IL-1p、IL-6以及IL-10的浓度。6.鼠妇物质基础研究本实验采用理化鉴别、薄层层析等技术和手段对鼠妇提取物中的生物碱、黄酮、皂苷、蒽醌、糖、氨基酸、甾类等大类成分进行考察和分析。根据该实验结果,本实验采用以HPLC为主的分析方法,运用不同色谱柱、洗脱系统以及紫外、蒸发光、质谱等多种检测手段分别从糖和氨基酸两大类成分的角度对鼠妇提取物中的活性成分进行深入研究,以药效学实验结果为依据,以相应的标准品作为对照,探索鼠妇药效的物质基础。7.鼠妇质量控制研究本课题按照《中国药典》通则以及相关的技术要求对五批不同产地及批次的鼠妇药材开展性状、鉴别、检查、浸出物以及氨基糖的含量测定等方面的研究工作,并进行相应的方法学考察。8.统计学方法实验数据以均数±标准误(x±S.E.M.)表示,采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,结果采用单因素方差分析,选用LSD法(最小显著差数法)或者Dunnett T3检验,P<0.05表示差异有统计学意义。实验结果：1.鼠妇有效部位的筛选本实验结果表明鼠妇水提物组和阳性药组小鼠的扭体次数与模型组相比有明显减少(P<0.05),而采用其他有机溶剂提取的样品均未能减少小鼠的扭体次数(P>0.05)。在鼠妇不同极性提取物HPLC谱图中,石油醚、乙酸乙酯样品色谱峰极少,随着提取溶剂极性的升高,样品中色谱峰相应增多,当以水作为提取溶剂时,其提取物色谱峰数量及峰面积最大。2.急性毒性实验根据急性毒性实验结果,所有动物在观察期内未出现明显的异常或毒性反应,提示鼠妇提取物的半数致死量大于5.0g/kg。3.鼠妇镇痛研究醋酸扭体实验结果显示,与模型组相比,鼠妇提取物(高剂量、中剂量)和吲哚美辛均可以减少小鼠的扭体次数(P<0.05)；在福尔马林模型的第二阶段,与模型组相比,鼠妇三个剂量组以及两个阳性组小鼠的舔足时间均有明显缩短(P<0.05),而在该模型的第一阶段,只有高剂量鼠妇组以及曲马多组小鼠的舔足时间有显著性降低。然而,在热板法实验中,鼠妇三个剂量组动物对热刺激的潜伏期与空白组相比未见明显变化(P>0.05),而灌胃曲马多的小鼠,其耐受时间明显延长(P<0.05)。4.鼠妇抗炎研究3.1.角叉菜胶致足肿胀实验由结果可知,与模型组相比,灌胃鼠妇提取物和阳性药吲哚美辛的小鼠,其足肿胀程度明显减小(P<0.05),且鼠妇三个剂量组小鼠在该模型的第一相的足肿胀指标均有不同程度的降低(P<0.05),而灌胃吲哚美辛的小鼠,其相应指标仅在该模型的第二相有所降低(P<0.05)。3.2.醋酸致毛细血管壁通透性升高实验给予鼠妇提取物(高剂量、中剂量)和吲哚美辛处理的小鼠,其毛细血管壁通透性升高的程度相较于模型组均有明显的降低(P<0.05)3.3.硫酸葡聚糖以及化合物48/80实验根据实验结果,灌胃鼠妇提取物和阳性药赛庚啶的小鼠,其足肿胀的程度在该两种炎症模型中均有明显的降低(P<0.05)。3.4.检测模型动物外周血中组胺的含量灌胃给予鼠妇提取物以及地塞米松的小鼠,其外周血中组胺的浓度相较于模型组显著降低(P<0.05)。4.鼠妇对炎细胞浸润的影响小鼠腹膜炎模型实验结果显示,模型组动物的各个指标相较于空白组均有明显升高(P<0.05)。与模型组相比,鼠妇药物组动物腹腔液中的总白细胞数量明显减少(P<0.05),MPO的活性显著降低(P<0.05)；促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及抗炎性细胞因子IL-10在腹腔液中的浓度均有明显的下降(P<0.05)；灌胃阳性药吲哚美辛的小鼠除IL-6外,其余上述指标相较于模型组小鼠均有明显的降低(P<0.05)。5.鼠妇物质基础研究首先,本实验发现,在氨基葡萄糖、鼠妇提取物及其水解产物样品的HPLC谱图中,在相同的保留时间处均有峰型一致的色谱峰,且对准品与鼠妇样品在MRM模式下具有相同的质谱行为。其次,在氨基酸类成分的分析方面,本实验结果表明鼠妇提取物与牛磺酸对照品在相同HPLC条件下均有同一色谱峰,且质谱行为一致(MRM模式)。再次,本研究发现,鼠妇提取物样品与精氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、色氨酸等氨基酸类成分在同一HPLC条件下具有相同的保留时间。此外,鼠妇水提取物经灰化处理后的样品,其色谱图中仍有较高的色谱峰,并且,氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化钙等标准品以及鼠妇提取物灰化样品在鼠妇提取物样品HPLC谱图的相同保留时间处均有峰型一致的色谱峰。6.鼠妇质量控制研究本研究建立了测定鼠妇药材中氨基多糖的紫外检测方法并进行方法学考察。根据测定结果,鼠妇药材中氨基多糖的平均含量为2.29%(以干燥品计)。其次,本实验以苯丙氨酸、缬氨酸为对照品,建立了鼠妇药材的TLC鉴别方法并进行方法学验证。此外,本实验对五批鼠妇药材的性状、鉴别、检查、浸出物等项目进行检测。实验结论：1.鼠妇有效部位的筛选实验表明,鼠妇水浸提取物具有镇痛活性,是该虫类药的有效部位,初步提示虫体中的活性成分具有极性大,易溶于水且不易溶于乙醇等特点。本实验由此确定了鼠妇有效部位的提取方法,其制备工艺为：鼠妇粉(80目)加入蒸馏水20倍,常温浸提(25±2℃)2次,每次8h,过滤,合并滤液,离心(1000rpm,20 min),上清液减压浓缩并冷冻干燥,即得。此外,鼠妇不同极性提取物的HPLC谱图表明,在鼠妇药材中,中小极性成分较少,而高极性物质在虫体中的含量较高,本实验佐证了上述有效部位筛选的实验结论。2.急性毒性实验急性毒性实验结果表明鼠妇的安全性较高,提示本研究所采用的3个给药剂量(0.4g/kg、0.6g/kg、0.8g/kg)均不会引起小鼠的急性毒性反应。3.鼠妇镇痛研究镇痛实验结果表明鼠妇水提取物具有镇痛的药理活性,而且进一步表明鼠妇的中枢药理活性不明显,其镇痛的作用环节以抑制外周炎症反应为主。4.鼠妇抗炎研究实验结果表明鼠妇具有抗炎作用,结合前述镇痛实验的研究结果,本课题证明了鼠妇具有缓解炎症性疼痛的药理作用,验证了鼠妇在古代及现代的临床应用。在此基础上,本课题对前述镇痛、抗炎实验模型及结果进行综合分析,推断并通过实验验证鼠妇抗炎的机理之一与抑制肥大细胞活性相关,并进一步发现该虫类药可以减少组胺等炎症介质的释放。5.鼠妇对炎细胞浸润的影响本研究表明鼠妇提取物不仅可以抑制炎细胞浸润的程度,而且可以抑制嗜中性粒细胞等炎细胞在炎症灶的活性,并能通过下调TNF-α、IL-1p、IL-6等炎症因子的表达等途径缓解炎症反应。结合上述研究,我们从炎性渗出和炎细胞浸润两个方面共同证明并初步阐述了鼠妇抑制炎症性疼痛的作用和机理。6.鼠妇物质基础研究首先,我们发现牛磺酸、氨基葡萄糖及其氨基多糖类成分是鼠妇提取物镇痛、抗炎的活性成分,这些活性组分均是本课题在鼠妇物质基础研究方面的首次发现。其次,虫体中所含的其他氨基酸类成分(如苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸等)具有一定的生物活性,是鼠妇镇痛、抗炎的辅助成分。最后,我们发现鼠妇提取物中存在较多的钠、镁、钾、钙等无机盐类成分。7.鼠妇质量控制研究本课题研究并建立了鼠妇药材的多个质量控制方法及检测指标,为其后续的研究以及临床应用奠定基础,在此基础上,根据五批药材的检测结果,初步以质量标准的格式形成草案,为鼠妇的药用开发以及质量标准的建立奠定基础。此外,基于上述药效学以及活性成分的研究结果,我们以中医药理论为指导,根据医学古籍记载并结合现代医学背景,对鼠妇提取物的镇痛、抗炎作用以及活性成分方面展开深入分析,并从抑制肥大细胞以及炎细胞活性等方面为鼠妇具有“虫类搜风”的功效特点予以科学的阐释并分析其在治疗痹症方面所具有的潜在开发价值,深化中医药理论,也为鼠妇后续的新药研究提供研究方向,奠定理论基础。