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目的:探讨芪蓟肾康总黄酮药理血清通过调节ERK、NF-κB及R-Smad信号转导通路对大鼠肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质积聚的影响。材料与方法:1芪蓟肾康总黄酮的制备:取黄芪、丹参分别用95%乙醇提取两次,每次一小时,滤过,滤液回收乙醇备用。将两味药的药渣与小蓟、白花蛇舌草、仙鹤草合并,加水16倍量,提取2次,每次提取1小时,滤过,合并水提液与黄芪和丹参的醇提液,浓缩,最终得到芪蓟肾康的浸膏(密度为1.12)。将芪蓟肾康浸膏上样于HPD100型大孔吸附树脂柱,吸附速率为1BV·h-1,用2BV水量,3BV的30%乙醇,4BV的50%乙醇洗脱,洗脱流速4BV·h-1,合并30%乙醇和50%乙醇洗脱液,浓缩,即为纯化的总黄酮,纯化后总黄酮含量提高到76%。2.芪蓟肾康总黄酮的药理血清制备:芪蓟肾康总黄酮的高、低剂量组分别按生药量30g/kg·d、15g/kg·d灌胃,每天一次;正常组灌服等量的生理盐水。连续灌胃5天,末次给药1小时后,腹主动脉取血备用,使用TDL-5-A型离心机,1500rpm离心5分钟,吸取上清液。经56oC水浴,30min灭活处理。使用直径为0.22μm的滤器过滤除菌,放置-20oC保存备用。3.大鼠肾小球系膜细胞的培养与分组:将肾小球系膜细胞接种于25cm2培养瓶中,加入含10%FBS的DMEM培养液,放置于37oC、5%二氧化碳孵箱中进行培养。约2-3天换一次液,待细胞达到80%-90%融合后,按2X104个/孔的浓度接种于24孔培养板,每组设置5个复孔。用含0.5%FBS的DMEM培养24小时后,更换含10%药理血清DMEM培养液继续培养48小时,收集细胞上清液待测。大鼠肾小球系膜细胞的分组:(1)正常组:10%正常大鼠血清(2)血管紧张素II组(模型组):10-7mol/LAngII+10%正常大鼠血清(3)芪蓟肾康颗粒总黄酮高剂量组:10-7mol/LAngII+10%总黄酮高剂量组血清(4)芪蓟肾康颗粒总黄酮低剂量组:10-7mol/LAngII+10%总黄酮低剂量组血清(5)氯沙坦组:10-7mol/LAngII+10%正常大鼠血清+10-2mol/L氯沙坦。4.应用免疫酶联吸附法测定待测样品的分泌量。(1)分别设置空白孔、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准空中加入标准品50μl;在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加入待测样品10μl轻轻晃动均匀,37oC温育30分钟。(2)弃去液体,甩干,每孔加满稀释后洗涤液,震荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复5次,拍干。(3)每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。轻轻晃动均匀,37oC温育30分钟。(4)弃去液体,甩干,每孔加满稀释后洗涤液,震荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复5次,拍干。(5)每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻晃动均匀,37oC避光显色10分钟。(6)取出酶标板,每孔加入终止液50μl,终止反应(此时蓝色立即转为黄色)。(7)测定:以空白孔凋零,在450nm波长下测量隔空的吸光度值(OD值)。测定在加终止液后15分钟内进行。(8)根据标准品的浓度及对应的OD值计算样品浓度。5.采用Real Time RT-PCR法检测ERK、NF-κB、FN、Smad2、Smad4、ColIV mRNA的表达:TRIzol法抽提总RNA。RNA浓度和纯度测定:取1μl RNA样本,加79μl DEPC水,紫外分光光度计测OD260与OD280,二者比值应1.8~2.0,提示样本中RNA纯度合格。RNA(μg/μl)浓度=OD260×40×80/1000。逆转录合成cDNA。PCR扩增结果:1芪蓟肾康总黄酮抑制AngII引起大鼠肾小球系膜细胞ERK活化:正常组大鼠肾小球系膜细胞分泌少量的ERK。经AngII刺激后,与正常组比较,模型组表达升高,且有显著差异(p<0.01),说明ERK可以被AngII基础活化;给予芪蓟肾康总黄酮及氯沙坦干预48小时后,与模型组比较,干预组ERK表达均减少,有显著差异(p<0.01),说明芪蓟肾康总黄酮能明显抑制在AngII的刺激下ERK表达的增加;芪蓟肾康总黄酮高剂量组与低剂量组之间无差异(p>0.05),说明芪蓟肾康总黄酮无量效关系;芪蓟肾康总黄酮高低剂量组与氯沙坦组比较,有差异(p<0.01),氯沙坦的作用优于芪蓟肾康总黄酮高、低剂量组。2芪蓟肾康总黄酮对AngII引起NF-κB信号通路活化的抑制作用:正常组大鼠肾小球系膜细胞分泌少量的TAK1、TRAF6、NF-κB。经AngII刺激后,与正常组比较,模型组表达升高且有显著差异(p<0.01),说明NF-κB信号通路可以被AngII基础活化。给予芪蓟肾康总黄酮及氯沙坦干预48小时后,与模型组比较,两组TAK1、TRAF6、NF-κB表达均减少,有显著差异(p<0.01),说明芪蓟肾康总黄酮能明显抑制在AngII的刺激下TAK1、TRAF6、NF-κB表达的增加;芪蓟肾康总黄酮高剂量组与低剂量组之间无差异(p>0.05),说明芪蓟肾康总黄酮无量效关系;芪蓟肾康总黄酮高低剂量组与氯沙坦组比较,有差异(p<0.01),氯沙坦的作用优于芪蓟肾康总黄酮高、低剂量组。3芪蓟肾康总黄酮对大鼠肾小球系膜细胞分泌FN的影响:正常组大鼠肾小球系膜细胞分泌少量的FN。AngII作为刺激因素,通过ERK及NF-κB信号通路,最终导致FN的表达升高,与正常组比较,模型组表达升高,有显著差异(p<0.01)。与模型组比较,总黄酮高剂量组、总黄酮低剂量组及氯沙坦组FN表达减少,有显著差异(p<0.01),说明芪蓟肾康总黄酮能明显抑制由于AngII刺激肾小球系膜细胞,通过ERK及NF-κB信号转导途径导致的FN过度异常分泌;芪蓟肾康总黄酮高剂量组与低剂量组之间无差异(p>0.05),说明芪蓟肾康无量效关系;芪蓟肾康总黄酮高、低剂量组与氯沙坦组比较,有差异(p<0.01),氯沙坦的作用优于蓟肾康总黄酮高、低剂量组。4芪蓟肾康总黄酮抑制AngII引起大鼠肾小球系膜细胞Smad2、Smad3的活化:正常组大鼠肾小球系膜细胞分泌少量的Smad2、Smad3。经AngII刺激后,与正常组比较,模型组表达升高,且有显著差异(p<0.01),说明Smad2、Smad3可以被AngII基础活化;给予芪蓟肾康总黄酮及氯沙坦干预48小时后,与模型组比较,两组Smad2、Smad3表达均减少,有显著差异(p<0.01),说明芪蓟肾康总黄酮能明显抑制在AngII的刺激下Smad2、Smad3表达的增加;芪蓟肾康总黄酮高剂量组与低剂量组之间无差异(p>0.05),说明芪蓟肾康无量效关系;芪蓟肾康总黄酮高、低剂量组与氯沙坦组比较有差异(p<0.01),氯沙坦的作用优于蓟肾康总黄酮高、低剂量组。5芪蓟肾康总黄酮对大鼠肾小球系膜细胞Smad4过度表达的影响:正常组大鼠肾小球系膜细胞分泌少量的Smad4。R-Smad信号通路被激活,与正常组比较,模型组Smad4表达升高,且有显著差异(p<0.01),说明R-Smad信号通路激活的同时,Smad4活性也增强。与模型组比较,总黄酮组及氯沙坦组Smad4表达减少,有显著差异(p<0.01),说明芪蓟肾康总黄酮能明显抑制Smad4表达的增加;芪蓟肾康总黄酮高剂量组与低剂量组之间无差异(p>0.05),说明芪蓟肾康无量效关系;芪蓟肾康总黄酮高、低剂量组与氯沙坦组比较有差异(p<0.01),氯沙坦的作用优于蓟肾康总黄酮高、低剂量组。6芪蓟肾康总黄酮对大鼠肾小球系膜细胞分泌ColIV的影响:正常组大鼠肾小球系膜细胞分泌少量的ColIV。AngII作为刺激因素,通过R-Smad信号通路,最终导致ColIV的表达升高,与正常组比较,模型组表达升高,有显著差异(p<0.01)。与模型组比较,总黄酮组及氯沙坦组ColIV表达减少,有显著差异(p<0.01),说明芪蓟肾康总黄酮能明显抑制由于AngII刺激肾小球系膜细胞,通过R-Smad信号转导途径导致的ColIV过度异常分泌;芪蓟肾康总黄酮高剂量组与低剂量组之间无差异(p>0.05),说明芪蓟肾康无量效关系;芪蓟肾康总黄酮高剂量组与低剂量组与氯沙坦之间比较,无统计学意义(p>0.05),说明芪蓟肾康总黄酮与氯沙坦的药效相同。结论:1.芪蓟肾康总黄酮延缓肾小球硬化的效应机制是通过抑制ERK及NF-κB信号转导通路,早期减少FN过度分泌实现的。2.芪蓟肾康总黄酮可以通过抑制R-Smad信号转导通路的活性,最终降低ColIV的过度表达,从而减轻肾小球系膜细胞增生及细胞外基质的堆积,延缓肾小球的损伤。3.芪蓟肾康总黄酮与氯沙坦均可降低FN及ColIV的表达,说明芪蓟肾康总黄酮有类氯沙坦样作用。4.芪蓟肾康总黄酮可以通过抑制ERK、NF-κB及R-Smad信号转导通路,从而减缓大鼠肾小球系膜细胞增生及细胞外基质的积聚,说明总黄酮是芪蓟肾康方的药效物质基础。5.芪藉肾康总黄酮通过ERK、NF-κB及R-Smad等3条信号转导通路,ERK、FN、NF-κB、TAK1、TRAF6、Smad2、Smad3、Smad4以及ColIV等9个作用靶点来实现减缓肾小球系膜细胞增生及细胞外基质的堆积的发生,防治肾小球的硬化的目的,体现出芪蓟肾康颗粒对于肾脏疾病治疗的多途径多靶点的作用机制。