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目的1.通过EP管结晶紫染色法、SEM法、TEM法等不同实验方法来鉴定铜绿假单胞菌生物被膜的形成及观察不同浓度黄芩苷对铜绿假单胞菌BF的干预作用。2.用荧光定量PCR法观察不同浓度黄芩苷对las R、rhl R和pvd Q基因作用后m RNA表达量是否存在显著性差异,分析黄芩苷对铜绿假单胞菌BF的干预作用与QS系统的相关性,在基因水平探讨黄芩苷干预铜绿假单胞菌BF的作用机制。方法1.实验以铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853为研究对象,采用EP管结晶紫染色法鉴定铜绿假单胞菌生物被膜的形成,并分别观察铜绿假单胞菌在培养72h、96h、120h、144h和168h(即第7天)后生物被膜形成状况。2.采用扫描电镜(SEM法)分别观察在黄芩苷15 mg/ml、7.5 mg/ml、3.75mg/ml浓度作用下对培养至第7天时铜绿假单胞菌生物被膜形态的影响。3.采用透射电镜(TEM法)分别观察黄芩苷在15 mg/ml、7.5 mg/ml、3.75mg/ml浓度下对培养至第7天时铜绿假单胞菌生成生物被膜形态的影响。4.采用96孔板定量测定法检测铜绿假单胞菌在黄芩苷15、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156mg/ml 8个不同浓度作用下144h内形成生物被膜的厚度。5.采用实时荧光定量PCR技术观察不同浓度黄芩苷对群体感应系统中与生物被膜生成密切相关的基因Las R、Rhl R及Pvd Q作用后m RNA表达水平的影响,并分析其相关性。结果1.EP管结晶紫染色法显示铜绿假单胞菌在培养到第5-7天左右EP管壁呈现紫色染最明显,提示铜绿假单胞菌生物被膜生成阳性。2.扫描电镜(SEM法)实验结果显示,在相同的培养时间下,空白对照组铜绿假单胞菌在培养第7天后在30000放大倍数下可观察到分化成熟且致密的生物被膜结构不均匀地黏附于锡纸表面,铜绿假单胞菌被浓厚的黏液样物质包裹在其中,仅有少量细菌菌体不完全游离于外;与空白对照组相比黄芩苷低剂量组(3.75mg/ml)铜绿假单胞菌在培养第7天后可见少量黏液状生物被膜存在,细菌附着于锡纸载体上呈现聚集和增殖状态;随着黄芩苷的浓度逐渐增加到高剂量(15 mg/ml)时,细菌胞间逐渐呈现无黏液状物质包裹,菌体呈长杆状分散分布,背景清晰,未见生物被膜存在,与空白对照组比较有明显性差异。3.透射电镜(TEM法)实验结果显示,在相同培养7天的时间下,空白对照组在负染色条件下背景清晰度很好,细菌形态立体饱满,大小不一,呈重叠样聚集生长,各菌体被不规则黏液样物质包裹;与空白对照组相比黄芩苷低剂量组(3.75mg/ml)浓度作用下细菌形态不均且分散不均匀,呈现菌体之间有纤维状物质连接的聚集生长状态,菌体周围可见碎片状、塔状或蘑菇状不规则成熟生物被膜结构。随着黄芩苷的浓度逐渐增加到高剂量时,铜绿假单胞菌呈分散生长,菌体边缘清晰,可见细菌鞭毛,未见明显生物被膜结构,与空白对照组比较有明显性差异。4.96孔板定量检测法实验结果:黄芩苷在15、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156mg/ml 8个剂量下,144h内均可影响铜绿假单胞菌生物被膜的生长;黄芩苷在0.625 mg/ml以上剂量时,在24、48、72、96、120、144 h各时间段生物被膜的厚度有显著性变薄,和空白对照组比较发现在统计学上存在显著性差异,有统计学意义(P<0.05);但是在0.312 mg/ml和0.156mg/ml剂量时的黄芩苷作用下铜绿假单胞菌的生物被膜在后期和空白对照组差别很小,无统计学意义(P>0.05)。5.实时荧光定量PCR实验结果显示,和空白对照组比较,黄芩苷在高、中和低剂量下均可降低las R、和pvd Q基因表达,在统计学上存在显著性差异,有统计学意义(P<0.05);黄芩苷在高剂量和中剂量时rhl R基因的m RNA表达量明显低于空白对照组,具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05);在黄芩苷低剂量时rhl R基因的m RNA表达量和空白对照组比较降低不明显,无统计学意义(P>0.05)。结论1.黄芩苷可以在铜绿假单胞菌生物被膜生成和成熟的过程中起明显干预作用,能分解大片状黏稠的生物被膜,降低生物被膜的厚度。2.不同浓度的黄芩苷能降低铜绿假单胞菌群体感应系统中与生物被膜生成密切相关的las R、rhl R基因和pvd Q基因m RNA的表达,提示这可能是黄芩苷干预铜绿假单胞菌生物被膜形成和成熟的作用机制。