研究背景：　　慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，与烟草烟雾等有害气体或颗粒对气道和肺组织慢性刺激有关。在中国，40岁以上人群COPD总的患病率是8.2％，在农村患病率是8.8%；COPD患者中有38.6%从不吸烟。越来越多的证据表明，室内空气污染尤其是生物燃料烟雾暴露与慢性阻塞性肺疾病密切相关。　　有研究指出，与肺气肿相比，小气道重塑在 COPD气流受限发生及进展中有着更重要的作用。基质金属蛋白酶是一类高度保守的依赖锌离子的肽链内切酶家族，参与细胞外基质重塑；明胶酶（MMP9、MMP2）是基质金属蛋白酶中一个亚类。虽然已有较多研究显示 MMP9、MMP2与肺气肿形成关系密切，但其在COPD气道重塑中的作用研究并不多。　　上皮—间质细胞转分化（EMT）是指上皮细胞在各种诱发因素作用下，经过多方面生化改变，失去与基底膜连接的细胞极性等上皮表型，而获得较高的迁移与侵袭、抗凋亡、产生细胞外基质等间质表型。有研究提示EMT可能参与了烟草烟雾暴露相关COPD的气道重塑。　　生物燃料烟雾暴露所致 COPD在临床表型方面与烟草烟雾暴露相关 COPD并不完全一致，且其发病机制相关研究极少。因此，本研究观察木材烟雾慢性暴露所致大鼠肺组织病理形态改变特点，并对其发病机制进行初步探讨。　　研究目的：　　观察木材烟雾慢性暴露对大鼠肺组织的影响，并研究明胶酶（MMP9、MMP2）和上皮—间质细胞转分化在木材烟雾慢性暴露大鼠气道重塑中所起的作用。以求进一步弄清生物燃料烟雾暴露所致 COPD的发病机制，从而寻找新的治疗靶点和途径。　　【研究方法】　　共48只雌性SD大鼠（体重180—220 g,8—9周龄），随机分成木材烟雾暴露组（WS）、烟草烟雾暴露组（CS）和空气对照组（Control）。本实验采用自制的全身式烟雾暴露装置，其烟雾分别产生于杉树锯末加热焖燃（30 g/天）、卷烟燃烧（20支/天）；大鼠暴露于烟雾中每天3小时，每周7天，持续暴露4个月和7个月。采用HE染色观察肺组织病理形态改变；Masson染色和I型胶原蛋白免疫组化染色来观察小气道管壁胶原蛋白沉积情况；采用ELISA法检测血清中TNF-α、MMP9、TIMP1含量；利用免疫组化法、Western blotting方法检测小气道管壁和肺组织MMP9、MMP2、TIMP1表达情况；应用免疫组化染色法来检测小气道管壁EMT相关蛋白标志物表达情况。　　在体外实验中，使用10μg/ml浓度的木材烟雾凝集物，刺激培养的大鼠气管上皮细胞7天，采用Western blotting方法检测细胞MMP9、MMP2表达水平；采用细胞免疫荧光染色法检测EMT相关蛋白标志物表达情况。　　实验结果：　　一、木材烟雾慢性暴露可导致大鼠肺组织出现COPD样病理形态改变　　1、大鼠体重减轻：　　在烟雾暴露开始之前，三组大鼠之间体重相似；当烟雾暴露7个月后，WS组和CS组大鼠体重与对照组比较均明显减轻，有统计学差异，CS组大鼠体重较BS组减轻更重些。　　2、肺气肿形成、小气道管壁增厚：　　HE染色结果提示，烟雾暴露4个月后，大鼠肺组织呈现COPD样病理学形态改变（肺气肿形成、气道管壁增厚、上皮纤毛脱落倒伏、小气道管腔内分泌物增多等）；烟雾暴露7个月后，病变进一步加重。与对照组比较，平均肺泡间隔在WS组、CS组明显增大，有统计学意义；小气道管壁厚度在BS组、CS组明显增厚，较对照组有统计学差异。　　3、小气道管壁胶原蛋白沉积增多：　　Masson染色显示，烟雾暴露4个月后，大鼠小气道管壁胶原蛋白沉积开始增多，但与对照组比较，并无统计学差异；烟雾暴露7个月后，WS组、CS组小气道管壁胶原蛋白增多明显，有统计学差异。烟雾暴露7个月后，I型胶原蛋白在BS组、CS组小气道管壁上沉积亦明显增多，与对照组比较有统计学意义。　　4、血清TNF-α升高：　　ELISA法检测结果显示，烟雾暴露7个月后，大鼠血清中TNF-α含量在WS组、CS组中均明显升高，较对照组有统计学差异。　　二、MMP9、MMP2在木材烟雾慢性暴露大鼠气道重塑中的作用研究　　1、免疫组化研究显示，MMP9、MMP2、TIMP1主要着色于气道上皮细胞、巨噬细胞，也可着色于成纤维细胞、淋巴细胞等。烟雾暴露7个月后，采用累积光密度半定量分析显示，MMP9、MMP2、TIMP1表达水平在WS、CS组小气道管壁中明显增多，较对照组有统计学差异。　　2、采用Western blotting方法检测肺组织中MMP9、MMP2表达情况，结果显示烟雾暴露4、7个月后，WS组、CS组中MMP9、MMP2表达均明显增多，有统计学差异。　　3、ELISA法检测结果提示，烟雾暴露7个月后，大鼠血清中MMP9、TIMP1在WS组、CS组均升高，较对照组有统计学差异。　　4、木材烟雾凝集物刺激培养的大鼠气管上皮细胞7天后，Western blotting检测结果提示MMP9、MMP2蛋白表达水平较对照组明显增高。　　三、EMT在木材烟雾慢性暴露大鼠气道重塑中的作用研究　　1、采用免疫组化单一染色法，发现木材烟雾暴露7个月后，大鼠小气道管壁上皮组织层可见到少量间质细胞标志物（vimentin、FSP1、α-SMA）阳性着色的细胞；采用免疫组化双染色法，发现小气道管壁上皮下粘膜组织层内可见到少量共染色细胞（E-cadherin+FSP1; E-cadherin+vimentin），这些结果提示小气道管壁部分成纤维细胞可能由气道上皮细胞经过EMT而来。　　2、木材烟雾凝集物刺激培养的大鼠气管上皮细胞7天后，相差显微镜观察可见部分上皮细胞由铺路石状生长的形态，转变为长梭形或星形、分散生长的间质细胞形态；采用免疫荧光染色方法显示，部分细胞可同时着色上皮细胞标志物和间质细胞标志物（E-cadherin+Type I collagen），提示部分上皮细胞可能发生了EMT。　　结论：　　1、木材烟雾慢性暴露可导致大鼠肺组织出现COPD样病理形态改变，与烟草烟雾暴露所致较相似。　　2、明胶酶（MMP9、MMP2）和EMT可能参与了木材烟雾慢性暴露大鼠的气道重塑。