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【研究背景及目的】肺癌是发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一,严重威胁人类生命和健康。全世界每年约有100万新发肺癌病人,我国的肺癌发病率几乎呈直线上升,1973年到1990年间肺癌发病率每年递增11.9%,预测到2025年我国每年死于肺癌者将高达90万人。世界卫生组织报告肺癌和艾滋病将是21世纪危害人类最严重的两种常见病。随着肿瘤治疗模式转变,肺癌治疗已从单一的手术或放疗进入到以手术为主的多学科综合治疗时代。继蒽环类、铂类之后又有很多疗效更好毒性更小的化疗药物如紫杉醇、多烯紫杉醇、草酸铂、吉西他滨等相继问世,但是这些化疗药物仍不能分辨肿瘤细胞和正常细胞;而毒副作用较小的靶向治疗药物,其价格昂贵有效率低,也限制了其临床应用。因此为提高肺癌的疗效,寻找多作用部位和作用方式并对正常细胞杀伤力小的抗肿瘤药物意义重大。三氧化二砷（As2O3）为一种从中药中提取的药物,可通过改变肿瘤细胞内多种信号转导途径,发挥抑制生长、促进分化、阻滞血管形成等细胞毒作用。我国首先将As2O3应用于急性早幼粒细胞白血病的治疗,进而研究发现它对多发性骨髓瘤、淋巴瘤等血液系统肿瘤及肝癌、乳癌、前列腺癌等实体瘤也有一定疗效。但是As2O3在肺癌中的作用仍然有待于进一步的深入研究。在实体瘤治疗中,组织供氧至关重要,肿瘤组织乏氧所致的乏氧应激蛋白和凋亡潜能缺失均可导致肿瘤组织对放疗和化疗的敏感性降低[2,3]。因此如何解决肿瘤组织的缺氧,提高化疗疗效,将是治疗实体肿瘤的一个关键问题。由于肿瘤组织自身发展无法改善低氧环境,而许多化疗药物在低氧环境中疗效降低甚至耐药,所以寻找一个能在低氧状态下仍然能够保持对肿瘤组织杀伤作用的药物就显得意义重大。有研究显示As2O3在低氧状态下仍然对一些肿瘤细胞具有杀伤作用[4,5,6,7],但是其在低氧环境下对肺癌细胞的作用却尚未可知,因此了解As2O3在低氧环境下对肺癌细胞的作用,对寻找新的治疗肺癌的化疗药物,提高肺癌的治疗效果具有重要意义。本研究在常氧（21%O2）和低氧（5%O2）两种不同环境下,采用多种不同浓度的As2O3分别作用于人肺腺癌细胞株A549细胞,并持续不同的时间,来观察比较两种环境下As2O3对A549的影响,了解As2O3对肺癌细胞的作用,为将来As2O3能够广泛应用于肺癌的临床治疗奠定基础。【实验内容】第一部分常氧环境下三氧化二砷对人肺癌细胞增殖和凋亡的作用材料与方法:实验采用人肺腺癌A549细胞株,在常氧（21%O2）环境下,用含10%小牛血清和青霉素链霉素双抗的F12K培养液传代培养。待细胞处于对数生长期时,采用含有三种浓度的As2O3 （1umol/L、2umo1/L和4umol/L）的培养液分别加入的人肺腺癌A549细胞中,观察12小时、24小时和48小时。用MTT比色法检测As2O3在常氧环境下对人肺腺癌A549细胞的生长抑制率,用流式细胞仪进行细胞周期和细胞凋亡检测。测量数据均以均数±标准差（X±S）形式记录,统计软件为SAS6.12,各组数据两两比较采用F检验,组间比较采用独立样本t检验,P﹤0.05判定为有统计学意义。结果:1.0常氧环境下MTT法检测As2O3对人肺腺癌细胞株A549的增殖抑制率:（表1）各浓度As2O3处理组间细胞增殖抑制率显著高于对照组（P<0.05）;各浓度As2O3处理组内不同作用时间的细胞增殖抑制率均有显著差异（P<0.05）,As2O3作用时间越长抑制效果越明显;且不同浓度As2O3对A549细胞增殖抑制率也有显著差异（P<0.05）,高浓度组要显著高于低浓度组。2.0常氧环境下As2O3对人肺腺癌细胞株A549凋亡率的影响:（表2）以Annexin V+/PI-判断为早期凋亡,Anexin V+/PI+判断为晚期凋亡细胞,两种凋亡率总和为总凋亡率。各浓度As2O3处理组的早期、晚期和总凋亡率均显著高于对照组（P<0.05）,各浓度As2O3处理组间早期和总凋亡率有显著差异（P<0.05）,高浓度组要显著高于低浓度组;而且在各个浓度的As2O3处理组中,不同作用时间的早期、总凋亡率有显著差异（P<0.05）,凋亡作用随着As2O3作用时间延长而增强。第二部分低氧环境下三氧化二砷对人肺癌细胞增殖和凋亡的作用材料与方法:实验采用人肺腺癌A549细胞株,在低氧（5%O2）环境下,用含10%小牛血清和青霉素链霉素双抗的F12K培养液传代培养。低氧环境通过应用BioMerieux公司的低氧培养袋创造。待细胞处于对数生长期时,采用三种浓度的As2O3注射液（1umol/L、2umo1/L和4umol/L）分别加入的人肺腺癌A549细胞中,观察24小时、48小时和72小时。用MTT比色法检测As2O3在低氧环境下对人肺腺癌A549细胞的生长抑制率,用流式细胞仪进行细胞周期和细胞凋亡检测。测量数据均以均数±标准差（X±S）形式记录,统计软件为SAS6.12,各组数据两两比较采用F检验,组间比较采用独立样本t检验,P﹤0.05判定为有统计学意义。结果:1.0低氧环境下MTT法检测As2O3对人肺腺癌细胞株A549的增殖抑制率:（表3、4）各浓度As2O3处理组间细胞增殖抑制率显著高于对照组（P<0.05）;各浓度As2O3处理组内不同作用时间的细胞增殖抑制率均有显著差异（P<0.05）,As2O3作用时间越长抑制效果越明显;而且不同浓度的As2O3对A549细胞增殖抑制率也有显著差异（P<0.05）,高浓度组要显著高于低浓度组。低氧环境下各浓度As2O3处理组的增殖抑制率与常氧环境对应组相比无显著差异（P>0.05）。2.0低氧环境下As2O3对人肺腺癌细胞株A549凋亡率的影响:（表5、6）以Annexin V+/PI-判断为早期凋亡,Anexin V+/PI+判断为晚期凋亡细胞,两种凋亡率总和为总凋亡率。各浓度As2O3处理组的早期、晚期和总凋亡率均显著高于对照组（P<0.05）,各浓度As2O3处理组间早期和总凋亡率有显著差异（P<0.05）,高浓度组要显著高于低浓度组;而且在各个浓度的As2O3处理组中,不同作用时间的早期、总凋亡率有显著差异（P<0.05）,凋亡作用随着As2O3作用时间延长而增强。低氧环境下各浓度As2O3处理组的凋亡率与常氧环境对应组相比无显著差异（P>0.05）。【结论】1、三氧化二砷能够抑制人肺腺癌A549细胞增殖并促进其凋亡,随着三氧化二砷浓度的提高和作用时间的延长,这种抑制增殖和促进凋亡的作用也随之增强。2、三氧化二砷能够在低氧环境下抑制人肺腺癌A549细胞增殖并促进其凋亡,而且与常氧环境下三氧化二砷的作用相同。3、三氧化二砷在1umol/L的作用浓度持续作用12小时即可发挥抑制人肺腺癌A549细胞增殖并促进其凋亡的作用,其敏感性高,而且起效迅速。4、三氧化二砷可能成为有效的治疗肺癌的药物。