猪表皮生长因子(porcine Epidermal Growth Factor，pEGF)是一种含有53个氨基酸的单链多肽类生长因子，与人、鼠等表皮生长因子类似，具有刺激细胞分裂、增殖与分化，促进离子交换和细胞外基质合成等生物学特性。有文献报道pEGF对提高母猪繁殖率及对抗断奶应激具有显著作用。表皮生长因子还对毛发的生长有抑制作用，并且呈剂量依赖。目前已有表皮生长因子作为脱毛剂的专利，应用于羊毛脱毛。研究表明当用毕赤酵母表达外源基因时，由于对信号肽切割不完全，在某些情况下，使得外源蛋白的N端带有信号肽的Glu-Ala残基而不能得到分子量单一的目的蛋白。本研究用毕赤酵母来表达pEGF的前48个氨基酸pEGF1-48，为生物药品生产打下基础。 为了获得分子量单一的pEGF1-48，以本研究室保存的pEGF基因为摸板，设计适当的引物进行扩增，使PCR产物的5端含有Xho Ⅰ限制性内切酶位点，且不含有编码信号肽末端Glu-Ala，残基序列，3端含有EcoR Ⅰ位点。将PCR产物与分泌表达载体pPIC9进行重组，构建了载体pPIC9-pEGF1-48，该重组载体的信号肽末端缺失了Glu-Ala的重复基因序列，然后使用电击转化方法把经过Bgl Ⅱ线性化的载体转入毕赤酵母中，获得稳定的转化子。通过用MM平板和MD平板筛选出Mut+和MutS型转化子。挑取已确定表型的转化子在含YPD培养基的96孔板中培养后，菌液于PCR管中，用酵母裂解酶lyticase破坏菌壁，释放出基因组DNA，用同位素标记随机引物斑点杂交法(dot-blotting)筛选多拷贝整合转化子。对多拷贝转化子在28℃条件下进行小量诱导表达，表达上清进行Tricine-SDS-PAGE电泳。结果在Tricine-SDS-PAGE电泳图中，工程菌在6kD处有一条蛋白条带，而且斑点杂交信号强，表明本研究成功地表达了pEGF1-48。 本研究中，由于表达的目的蛋白不带任何标签，所以不能采用一般简易的亲和层析法来对蛋白进行纯化。本研究建立了硫酸铵沉淀及超滤的方法来对蛋白浓缩和纯化，采用硫酸铵梯度沉淀法确定了硫酸铵沉淀目的蛋白的最佳百分比浓度为85％，把通过硫酸铵沉淀的目的蛋白进行截留分子量为30kD和3kD膜的超滤，超滤后的蛋白进行Tricine-SDS-PAGE电泳，结果表明纯化的效果很好，未见到杂蛋白条带。采用Bradford检测方法对蛋白浓度进行了初步测定，结果目的蛋白pEGF1-48的表达水平约为34mg/L。 本研究成功地构建了分泌型表达载体pPIC9-pEGF1-48，筛选了多拷贝整合子，并表达了pEGF1-48，初步建立了纯化pEGF1-48的方法，为pEGF1-48高密度发酵生产pEGF1-48，作为生物药品生产打下基础。