近年来，随着工农业的发展，大量的合成化合物不断释放到环境中，对环境、生物和人体健康造成巨大危害。其中一些具有激素样作用的物质被称为环境内分泌干扰物（endocrinedisrupting chemical，EDC），可导致人和动物内分泌系统功能异常（性激素和甲状腺激素分泌障碍）、生殖器官异常（如精子减少、睾丸癌、乳腺癌）、神经系统异常（如智能低下、多动症）和免疫系统异常（过敏性疾病增加），严重威胁动物和人类的生殖健康。由于诱导氧化损伤是EDC生殖毒性机制中一个最重要的途径，那么具有抗氧化活性的物质，尤其是食源性的植物性化合物，就可能预防EDC的毒性。而黄酮类化合物（又名类黄酮）是一类广泛分布在多种植物中的多环酚类化合物，具有多方面的生物活性，抗氧化活性是类黄酮的一个最基本的生物活性。由于EDC能引起自由基的产生和氧化损伤，而类黄酮具有清除自由基、螯合金属离子的抗氧化作用，加之目前关于类黄酮与EDC相互作用的机理还没有阐明，为此，本研究以生殖细胞培养作为模型，主要从细胞生物学角度探讨并阐明类黄酮缓解EDC引起的生殖毒性机理，为食源性类黄酮用于防治氧化性EDC生殖毒性提供理论指导。1．生殖细胞培养模型的建立和应用用胶原酶分散18胚龄鸡胚的睾丸，建立生殖细胞-体细胞的无血清共培养模型，培养液中添加了10μg／mL胰岛素、5μg／mL转铁蛋白和3×10^-8 mol／L亚硒酸钠（称ITS培养液）。在该培养模型中，生殖细胞呈圆形生长，而体细胞呈梭状生长。促有丝分裂物质如胰岛素和转铁蛋白能维持生殖细胞的存活。胎牛血清能促进细胞的存活，但细胞生长过于旺盛以至难以观察生殖细胞形态的变化。而无血清ITS培养体系可防止体细胞的过度增殖，体细胞呈单层生长便于显微镜下观察生殖细胞的形态变化。用免疫细胞化学法进一步证实了生殖细胞呈c-kit（干细胞因子的配体）染色阳性，而体细胞呈阴性。另外，腺垂体激素卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）能增强生殖细胞表达c-kit，促进生殖细胞的增殖。不同来源的典型EDC包括工业来源的多氯联苯如Aroclor 1254（A1254，0.1～10μg／mL）对生殖细胞的毒性作用和激素样作用依赖于剂量和作用时间。农业来源的除草剂2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D，25～100μg／mL）及医药来源的化疗药物白消安（25～100μg／mL）对生殖细胞呈现毒性作用并存在剂量-效应关系。从形态和功能两方面证明本实验所建立的鸡胚睾丸生殖细胞-体细胞无血清共培养模型可作为体外评价内源性激素和外源性物质如EDC生物活性的一种简易、快速、准确并且易于观察的离体模型，还可用于生殖毒理和繁殖营养调控机理的研究。2．促性腺激素和性激素对睾丸生殖细胞增殖的作用及其机理分析生殖细胞的增殖和发育受多种内源性激素的调控，其中最为重要的是由腺垂体分泌的FSH和性腺间质细胞分泌的性激素。为此，本研究以生殖细胞-体细胞共培养为实验模型，对FSH和睾酮（testosterone，T）及17β-雌二醇（estradiol，E₂）调控鸡胚睾丸生殖细胞增殖的作用进行了探讨。结果发现FSH（0.25～1.0 IU／mL）可显著促进生殖细胞的增殖（P＜0.05）。与对照组相比，FSH（0.25～1.0 IU／mL）组中增殖细胞核抗原标记率（PCNA-LI）明显增高（P＜0.05）。T(10^-7～10^-6mol／L)和E₂（100 ng／mL）均能显著促进生殖细胞的增殖（P＜0.05），T(10^-7～10^-6mol／L)可显著增加PCNA-LI（P＜0.05）。此外，FSH与T共同处理作用更加显著且高于各单独处理组，表明FSH和T可协同刺激鸡胚睾丸生殖细胞的增殖。以上结果表明，生殖细胞-体细胞共培养模型中生殖细胞对FSH和性激素具有较好的反应性，FSH和T及E₂可通过共培养模型中的支持细胞分泌的一些旁分泌因子而间接作用于生殖细胞，从而促进生殖细胞的增殖。3．大豆黄酮对多氯联苯引起的生殖细胞氧化损伤的缓解作用及其抗氧化机理的研究多氯联苯（polychlorinated biphenyls，PCB）是一种难分解的氯代芳烃族内分泌干扰物，对人和动物健康造成严重危害。由于过去大量使用且难分解并通过生物链累积，因此PCB在环境中仍然普遍存在。而大豆黄酮（daidzein，DAI）是一类广泛分布在豆类植物中的多酚类化合物，具有抗氧化作用和雌激素活性。本研究以生殖细胞-体细胞共培养为实验模型探讨了DAI对PCB（以A1254为代表）引起的生殖细胞氧化损伤的缓解作用及其机理。结果发现0.1～1μg／mL的A1254促进生殖细胞的增殖（P＜0.05）而呈现出雌激素样作用，而10μg／mL的A1254则导致生殖细胞核染色质固缩，培养初期细胞就出现脱落和崩解，产生严重的细胞毒性并能被维生素E缓解。培养48h后，A1254呈现出激素样作用，能被雌激素受体阻断剂他莫昔芬（tamoxifen）或雄激素受体阻断剂氟硝丁酰胺（flutamide）阻断，导致细胞损伤作用增强。鉴于A1254对生殖细胞较强的毒性作用，本实验对其机理进行深入探讨，包括评价细胞膜完整性（乳酸脱氢酶，loctate dehydrogenase leakage，LDH）、脂质过氧化水平（丙二醛，malondialdehyde，MDA）及抗氧化防御体系的变化（超氧化物歧化酶，superoxide dismutase，SOD；谷胱甘肽，glutathione，GSH）。结果证明A1254显著增加LDH释放量和MDA的生成，显著降低SOD活性和GSH含量（P＜0.05），从而证实了A1254通过细胞氧化损伤而引起生殖细胞的毒性。添加植物性抗氧化剂DAI则可缓解A1254的细胞毒性，细胞活性得到恢复，LDH释放量、MDA含量、SOD活性和GSH含量恢复到对照组水平。表明DAI通过抗氧化作用缓解了A1254引起的氧化损伤。此外DAI还能促进生殖细胞增殖，其增殖作用能被他莫昔芬阻断，证实DAI具有雌激素样作用。以上结果说明A1254通过其毒性和雌激素样双重作用导致生殖细胞发育障碍。而植物性抗氧化剂DAI虽然具有弱的雌激素样作用，但可显著缓解A1254引起的生殖细胞的氧化损伤作用，因此食源性的DAI对于人类和动物由于氧化性EDC引起的生殖障碍具有重要的防治作用。4．槲皮素对EDC引起的生殖细胞氧化损伤的缓解作用及其抗氧化机理的研究槲皮素是一种黄酮醇类黄酮类化合物，在蔬菜和水果等植物中含量丰富，具有抗氧化作用。本实验利用生殖细胞-体细胞共培养模型研究了槲皮素对EDC（A1254和2，4-D）引起的氧化损伤的缓解作用及其机理。实验表明A1254和2，4-D显著增加LDH释放量，对睾丸细胞造成损伤。A1254和2，4-D还可显著增加MDA生成量，使细胞发生脂质过氧化，并能降低SOD活性和GSH含量，破坏细胞内的抗氧化防御体系。然而，槲皮素在所处理的剂量范围内（0.01～1μg／mL）对生殖细胞无毒性，但能抑制A1254和2，4-D的负面作用，降低了MDA生成量、增加了SOD活性、提高GSH含量以维持细胞膜的完整性，从而证实了槲皮素的抗氧化活性保护了生殖细胞免受A1254和2，4-D的氧化损伤。结果提示具有抗氧化活性的黄酮类化合物可用于EDC生殖毒性的化学防治。结论：本实验建立了鸡胚睾丸生殖细胞-体细胞共培养模型，发现c-kit可以作为生殖细胞的标记物之一。FSH促进生殖细胞表达c-kit，并与T协同提高PCNA的表达，刺激生殖细胞的增殖。E₂也能促进生殖细胞的增殖。A1254对生殖细胞具有毒性和激素样的双重作用，而2，4-D和白消安具有毒性作用。A1254和2，4-D可引起生殖细胞氧化损伤，破坏细胞膜的完整性，同时引起脂质过氧化，损伤细胞内抗氧化防御体系。而黄酮类化合物DAI和槲皮素通过抗氧化作用抑制A1254和2，4-D引起的氧化损伤，保护细胞的活性。因此，具有抗氧化活性的植物源黄酮类化合物能够缓解EDC的氧化损伤，防止EDC的生殖毒性，这为阐明天然黄酮类化合物的抗氧化作用机理和防治氧化性EDC的生殖毒性提供了理论基础。