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研究目的:在既往课题研究的基础上,观察研究二硫化二砷和粉防己碱对三阴性乳腺癌的联合作用。研究方法:1.细胞实验:(1)MTT方法检测不同浓度条件下二硫化二砷、粉防己碱单独及联合干预后的三阴性乳腺癌细胞株HCC1937不同时点的抑制率,利用中效原理(Chou-Talalay法)评判药物的联合作用(协同作用、相加作用、拮抗作用),筛选最佳药物浓度组合;观察药物作用48H后的HCC1937细胞形态变化;(2)采用流式细胞技术,通过双染色法观察分析两药作用48H后对于HCC1937细胞凋亡的影响;(3)Transwell法检测药物作用48H后对三阴性乳腺癌细胞HCC1937侵袭力的影响;(4)Elisa检测二硫化二砷、粉防己碱干预后,细胞中与砷的吸收排泄相关蛋白AQP-9以及耐药蛋白ABCC2、P-gp含量;(5)通过实时荧光定量qPCR方法,检测凋亡相关基因Caspase-3、survivin、Bid、Bax、Bcl-2、PARP 在药物作用 48H 后的表达情况;(6)采用Western Blot方法检测两药干预后48H后,HCC1937细胞中Caspase-3、survivin、Bid、Bax、Bcl-2、PARP蛋白的表达。2.三阴性乳腺癌荷瘤裸鼠模型的体内实验:构建人三阴性乳腺癌荷瘤裸鼠模型,观察研究雄黄、汉防己甲素片单用及联合使用对肿瘤的作用,并与卡培他滨片对比,通过病理切片分析、免疫组化、qPCR、Western Blot等技术,阐述分析药物的作用机制。研究结果:体外细胞实验:1.MTT实验:(1)二硫化二砷在浓度2.5～40μg/ml条件下作用24H、48H、72H后,可在体外抑制三阴性乳腺癌细胞HCC1937的增殖,其抑制作用依赖于药物浓度和药物作用时间,并且与这两方面呈正相关性;粉防己碱在浓度2～12μg/ml条件下,作用24H、48H、72H后,可抑制三阴性乳腺癌细胞HCC1937的增殖,其抑制作用与药物的浓度和作用时间呈正相关性。(2)用药48H后,二硫化二砷与粉防己碱的合药浓度为18μg/ml+12μg/ml和1.5μg/ml+1μg/ml时,为拮抗作用;浓度为3μg/ml+2μg/ml为相加作用;浓度为6μg/ml+4μg/ml为协同作用。且二硫化二砷和粉防己碱的合药浓度组合在3μg/ml+2μg/ml和6μg/ml+4μg/ml时,合药对HCC1937细胞的抑制作用明显强于单药。(3)二硫化二砷、粉防己碱随浓度增加,对细胞的杀伤力也增加,可明显改变细胞形态,二硫化二砷和粉防己碱合药3μg/ml+2μg/ml和6μg/ml+4μg/ml两个浓度效果优于单药。2.二硫化二砷3～18μg/ml以及粉防己碱2～12μg/ml均可引起细胞凋亡,两种药物单药使用时诱导凋亡的效果与药物浓度呈正相关性。两药合用三个浓度组合也可以诱导细胞凋亡,3μg/ml+2μg/ml、6μg/ml+4μg/ml要优于单药,存在协同作用的浓度组合6μg/ml+4μg/ml要优于存在相加作用的浓度组合3μg/ml+2μg/ml。3.二硫化二砷和粉防己碱及合药在高浓度条件下可以抑制HCC1937侵袭力,合药效果较之对应浓度单药效果差异不大。4.As2S2和Tet合药干预48H后,可明显降低细胞HCC1937中AQP9、ABCC2和P-gp含量,协同作用浓度As2S2+Tet 6μg/ml+4μg/ml效果最好,其次为相加作用浓度As2S2+Tet3μg/ml+2μg/ml。单药下调作用与浓度呈一定正相关性。5.二硫化二砷和粉防己碱单用或合用干预48H后,可上调Caspase-3、Bax、Bid表达,下调Bcl-2、PARP表达实现HCC1937细胞凋亡的诱导,从而产生抑制HCC1937细胞作用,且在协同作用浓度条件下合用两药效果明显优于单药作用。体内实验:1.雄黄、汉防己甲素片以及两药合用,在一定程度上均可以抑制乳腺癌肿瘤的生长,其中合药效果要明显于单用;2.雄黄、汉防己甲素片以及两药合用对裸小鼠肝肾功能影响不大,对裸小鼠肝、肾损伤不明显,合药存在改善趋势;3.从组织病理学分析,雄黄、汉防己甲素片以及两药合用,可对肿瘤产生杀伤作用,且合药效果优于单用;4.通过免疫组化以及RT-PCR、Western blot实验结果分析,雄黄(二硫化二砷)、汉防己甲素片以及两药合用,均可通过上调Caspase-3、Bax表达,下调Bcl-2表达,产生抑制肿瘤作用,两药合用效果较单药使用更明显,其作用机制可能是通过调控肿瘤凋亡实现。研究结论:1.二硫化二砷和粉防己碱,单药及合药可明显抑制三阴性乳腺癌细胞HCC1937,两药在协同、相加条件下,优于单药,其作用机制可能是通过调节Caspase-3、Bax、Bcl-2、Bid等与细胞凋亡相关因子,诱发肿瘤细胞凋亡产生的。2.粉防己碱可以影响AQP-9调整或降低细胞内砷含量,增加细胞对二硫化二砷的敏感性,可推断两药可能存在“减毒增效”关系;并且两药合用可通过调整耐药因子ABCC2和P-gp含量实现增强细胞对药物敏感性。3.雄黄和汉防己甲素片可有效抑制体内肿瘤生长,其作用机制也是在于调控与细胞凋亡相关的Caspase-3、Bax、Bcl-2、Bid等因子实现的,且两药合用,效果优于单药。两药配伍干预三阴性乳腺癌具有一定合理性和科学性。