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目的:1.系统研究蒽醌修饰物P作用于人肝癌Hep G2、Hep3B细胞后细胞形态学变化,推测蒽醌修饰物P诱导肝癌细胞的死亡模式;2.通过对比分析旁凋亡与典型凋亡、自噬间的差异,明确旁凋亡发生的分子特征。3.结合旁凋亡抑制剂,初步探讨蒽醌修饰物P诱导肝癌细胞旁凋亡的信号传导通路。方法:以肝癌细胞Hep G2和Hep3B为研究对象,蒽醌修饰物P为受试物。1.MTT法检测细胞增殖的情况。2.HE染色结合光镜实验观察细胞形态学的变化。3.内质网探针ER-Tracker Red结合激光共聚焦显微镜确定细胞空泡的来源;线粒体探针Mito-Tracker Green结合激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体损伤情况。4.透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化。5.流式细胞仪检测细胞周期分布以及细胞凋亡情况。6.Western Blotting实验测定凋亡相关蛋白PARP、Bcl-2和Bax;自噬相关蛋白LC3和p62;旁凋亡蛋白Alix以及内质网应激相关蛋白GRP78、PERK、ATF6、IRE1、ATF4、e IF2α和p-e IF2α蛋白水平的变化。7.Stub RFP-sens GFP-LC3自噬双荧光慢病毒监测自噬流的形成。结果:1.MTT结果显示,蒽醌修饰物P对于Hep G2,Hep3B两种细胞增殖具有较好的抑制作用,IC50分别为6.2μM和12.8μM均优于先导化合物大黄酸。联合凋亡抑制剂Z-VAD作用后不能逆转蒽醌修饰物P诱导的细胞死亡,而联合旁凋亡抑制剂CHX可使Hep G2细胞的存活率显著提高（P<0.05）。2.光镜下观察发现,蒽醌修饰物P可以诱导细胞产生大量空泡,其空泡诱导的细胞损伤不可逆;结合HE染色结果发现细胞空泡出现在细胞核周围,并且随着时间延长,空泡增加,细胞质流失。3.激光共聚焦显微镜下可见蒽醌修饰物P引起的细胞空泡出现在细胞核边缘可被ER-Tracker Red阳性标记包围,提示空泡来源内质网;Mito-Tracker Green染色发现,蒽醌修饰物P作用后细胞线粒体从棒杆状变为圆点状,提示细胞线粒体受损。4.透射电镜结果表明,蒽醌修饰物P作用后,细胞内质网肿胀、呈中度至重度扩张并形成大量胞浆空泡,空泡内含少量絮状物,在重度的扩张的粗面内质网膜上的颗粒呈不同程度的脱失,同时可观察到线粒体出现肿胀、嵴消失等改变,但细胞膜结构仍保持完整,细胞核无明显皱缩,且未观察到凋亡小体以及自噬溶酶体。5.流式细胞结果显示,Hep G2细胞空白对照组G2/M期为20.67%,采用4,8,16μM的蒽醌修饰物P作用24 h后,G2/M期所占比例上调为21.68%,29.79%和37.61%;Hep3B细胞空白对照组G2/M期为22.39%,蒽醌修饰物P作用后,Hep3B细胞G2/M期所占比例上调为39.65%,43.99%和45.37%;细胞凋亡检测发现,2,4,8μM蒽醌修饰物P作用Hep G2细胞48 h后,细胞早凋率分别为3.88%、7.30%和8.61%,Caspase抑制剂Z-VAD与8μM蒽醌修饰物P联合作用,细胞早凋率为8.22%。而凋亡诱导剂顺铂10μM作用细胞后,Hep G2细胞的早凋率为64.94%,显著高于空白对照组6.00%（P<0.05）,同时顺铂与Caspase抑制剂Z-VAD联用后,可显著下调细胞凋亡率至32.00%（P<0.05）。同样的2,4,8μM蒽醌修饰物P作用Hep3B细胞后,细胞早凋率分别为5.95%、6.25%和8.88%,Caspase抑制剂Z-VAD与8μM蒽醌修饰物P联合作用,细胞早凋为率为7.81%,未对细胞凋亡率有明显改变。而顺铂10μM作用Hep3B细胞的早凋率为49.36%,显著高于空白对照组5.00%（P<0.05）,且与Caspase抑制剂Z-VAD联用后,可显著下调细胞早凋亡率至24.72%（P<0.05）。6.Western Blotting结果显示,蒽醌修饰物P作用Hep G2,Hep3B细胞后,凋亡相关蛋白PARP未出现剪切型,抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表达水平无明显变化;自噬相关蛋白LC3-II明显激活,LC3-II/LC3-I比值增加,P62表达水平随时间逐渐增加或无明显变化。蒽醌修饰物P作用6～12 h便可明显抑制细胞Alix蛋白表达（p<0.05）。持续上调GRP78蛋白水平,细胞内质网应激相关蛋白PERK、p-e IF2α、ATF4最先被激活,且蛋白表达水平维持在较高水平至48 h,其中ATF4激活现象最为明显。而蒽醌修饰物P作用于不同时间点后ATF6和IRE1蛋白未见明显变化。采用旁凋亡抑制剂CHX与蒽醌修饰物P联合作用后,Alix蛋白表达升高,同时GRP78、ATF4蛋白表达受到抑制。7.自噬流结果表明,Hep G2,Hep3B细胞分别加入蒽醌修饰物P、自噬抑制剂氯喹和自噬激活剂雷帕霉素后,黄色斑点的数量均多于对照组细胞（均P<0.05）;而加入雷帕霉素的细胞,除了黄色斑点增加,红色荧光斑点也显著增加（P<0.05）;当蒽醌修饰物P与雷帕霉素共同作用后,红色荧光斑点下降。提示蒽醌修饰物P处理的细胞未发生自噬性死亡。结论:1.蒽醌修饰物P具有良好的抗肝癌活性。2.蒽醌修饰物P杀伤肝癌的细胞形态学变化符合旁凋亡特征。3.蒽醌修饰物P诱导的旁凋亡是一种非Caspase依赖性死亡,无凋亡和自噬性死亡的发生。4.蒽醌修饰物P诱导细胞旁凋亡与细胞内质网应激相关,其PERK-e IF2α-ATF4通路可能是蒽醌修饰物P诱导旁凋亡的信号通路。