目的：骨肉瘤是儿童和青少年长骨上最常见的恶性肿瘤,在对这种肿瘤的治疗中,人们发现其常常会对化疗药物产生耐药,并最终导致治疗失败,但其耐药的具体分子机制尚不清楚。我们所研究的HMGB1是一种核内DNA结合蛋白,在许多细胞内都有表达,作为DNA的结合蛋白,HMGB1参与了DNA的复制、重组和转录,其分泌形式又可发挥细胞因子样作用,在骨肉瘤耐药性形成过程中HMGB1就是以分泌形式发挥免疫调节作用的。本课题初步研究HMGB1在骨肉瘤对化疗药物耐药中所起的作用和机制。方法：在体外的细胞水平研究中,我们通过使用阿霉素、顺铂和氨甲喋呤等抗肿瘤化疗药物作用于骨肉瘤细胞MG-63、SaOS-2和U-20S后,采用Western blotting, TUNEL,免疫共沉淀,RNAi介导敲除,cDNA转染,免疫荧光显像分析,流式细胞技术,电镜等检测技术和手段分析HMGB1的表达以及其与自噬和骨肉瘤耐药的作用。结果：在体外的细胞水平研究中,我们通过使用阿霉素、顺铂和氨甲喋呤等抗肿瘤化疗药物作用于骨肉瘤细胞MG-63、SaOS-2和U-20S后,发现骨肉瘤细胞内HMGB1显著上调,并具有时间依赖性。而采用RNAi介导方式敲除HMGB1后可以观察到恢复了骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性。而用HMGB1cDNA转染骨肉瘤细胞促进其过度表达HMGB1后,可以观察到骨肉瘤细胞对顺铂、阿霉素和氨甲喋呤耐药增强。在进一步的实验中我们发现,HMGB1的过度表达增加了LC3I向LC3Ⅱ的转化,LC3己知被广泛应用于检测自噬。敲除PI3KC3、Beclin1和Atg7等自噬调节因子后,改变了HMGB1所诱导的抗化疗作用,这一作用减少了自噬增加了凋亡。通过免疫印迹分析和免疫荧光显像分析后发现,敲除HMGB1抑制了化疗所诱导的LC3Ⅱ的表达,而且通过LC3抗体或者mRFP-GFP-LC3结构抑制LC3后可以明显减少LC3在细胞内的聚集,在进一步评估了p62的表达后发现HMGB1的敲除也减少了p62自噬降解数量。这一系列实验支持HMGB1在骨肉瘤细胞调节自噬中发挥了关键作用。随后的研究中我们还发现,由于雷帕霉素可以诱发自噬,而HMGB1的敲除明显减少了雷帕霉素所引起的细胞自噬,雷帕霉素对细胞的保护作用也随之减少,这再一次说明HMGB1在自噬调节的细胞存活中也发挥重要作用。为了研究HMGB1调节自噬的潜在机制,我们通过免疫印迹分析和免疫沉淀分析等实验手段,分别检测了骨肉瘤细胞内ULK1、mAtg13、FIP200、Beclin1和PI3KC3等蛋白表达情况,证实在骨肉瘤细胞内HMGB1和Beclinl可以形成复合体,敲除ULK1和FIP200的蛋白表达后抑制了HMGB1和Beclin1之间的相互作用。这说明HMGB1可以结合自噬调节子Beclin1并通过调节Beclin1-PI3KC3复合物的形成来促进自噬进行。而HMGB1和Beclin1之间的复合物的形成还依赖自噬复合物ULK1-mAtg13-FIP200的参与。抑制自噬中的这些通路将增加化疗药物敏感性。在动物体内研究中,我们将MG-63肿瘤细胞接种到实验鼠背部,用阿霉素进行治疗后发现,HMGB1敲除的肿瘤细胞接种鼠肿瘤大小较对照组明显减小。同时检测LC3发现实验组LC3分布减少,而用TUNEL检测凋亡后发现实验组凋亡明显增加。这说明与对照组相比,HMGB1特异shRNA转染的肿瘤细胞在治疗后减少了自噬并增加了凋亡。动物体内实验进一步证实,HMGB1在调节骨肉瘤细胞的耐药性方面有重要作用。综上所述,HMGB1作为自噬调节子在化疗药物耐药性的产生中发挥了重要作用,这一发现将为骨肉瘤治疗提供新的研究方向。结论：化疗药物阿霉素、顺铂和氨甲喋呤促进骨肉瘤细胞MG-63,SAOS-2和U-2OS内HMGB1表达；在体外实验中抑制HMGB1增加了骨肉瘤细胞对化疗的敏感性；体外实验中HMGB1的过量表达增加了骨肉瘤细胞对化疗的耐药性；动物实验证实抑制]HMGB1表达恢复骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性；HMGB1调节骨肉瘤细胞化疗过程发生的自噬；在骨肉瘤细胞化疗过程中HMGB1参与调节自噬中Beclinl-PI3KC3复合物的形成而不对ULK1-mAtg13-FIP200复合物起作用。