志贺氏菌(Shigella)是一种肠道感染型致病菌,也是引起发展中国家细菌型食物中毒的主要致病菌。近年来,志贺氏菌引起的食物中毒事件时有发生,不仅危害人类生命健康,而且对公共卫生安全有严重的影响。目前,微生物检测方法仍以常规方法中分离培养和生化鉴定为主,该检测方法耗力耗时,灵敏度低,不能满足快速检测的需求。因此,开发一种快速灵敏、简单高效的志贺氏菌检测方法至关重要。本研究建立了一种定量检测食品中志贺氏菌的方法——实时荧光定量跨越式滚环等温扩增(Real-time fluorescence quantification saltatory rolling circle amplification,qSRCA),该方法以志贺氏菌的ipaH基因为靶基因设计特异性引物,利用正交试验对qSRCA反应条件和反应体系进行优化,通过实时荧光曲线监测整个qSRCA反应的进程,根据起始循环数对检测结果进行判定。本研究对qSRCA的反应条件和反应体系进行优化,确定的适宜反应温度为64℃,适宜的反应体系为:0.75 μM正反向引物,0.50 mM dNTPs,2.00mMMg2+,2.50μLBst DNA聚合酶缓冲溶液,0.48 U/μLBst DNA聚合酶,1.00 μLDNA模板,1.00μL EvaGreen(20 ×),双蒸水补足体系至 20.00 μL。基于上述适宜的反应体系和反应条件构建质粒,以重组质粒为模板进行qSRCA反应,对扩增产物送样测序并分析,充分地证实了扩增结果的准确性。建立了 qSRCA标准曲线,其表达式为y=-1.9489 × x+26.7642,相关系数R2值为0.9972,表明此方法的Ct值与重组质粒拷贝数的对数线性关系良好。本研究共选取50株菌株包括16株志贺氏菌和34株非志贺氏菌进行qSRCA反应,用以验证方法的特异性。分析结果可得:16株志贺氏菌呈阳性结果,34株非志贺氏菌为阴性结果,表明qSRCA方法具有良好的特异性。将重组质粒进行10倍梯度稀释,对各梯度稀释液进行qSRCA反应,确定该方法的灵敏度,并与qPCR方法比较。结果显示:qSRCA方法的灵敏度为8.87 ×101 copies/μL,qPCR方法的灵敏度为8.87 × 102 copies/μL。提取各梯度人工污染牛乳样品的DNA,进行qSRCA及qPCR反应。结果显示,人工污染牛乳样品中的志贺氏菌 qSRCA 的定量限为 6.7 × 100CFU/mL(4.268 × 102 copies/μL),qPCR 方法的定量限为 6.7 × 101 CFU/mL(4.975 × 103 copies/μL)。由此可得,qSRCA 方法的灵敏度比qPCR方法灵敏度高10倍,qSRCA方法的定量限比qPCR的低10倍。表明qSRCA方法适用于实际样品中志贺氏菌的定量检测。本研究使用qSRCA方法及国家标准GB 4789.5-2012方法对60份食品样品进行志贺氏菌检测。qSRCA方法检出2份阳性结果,国标方法检出1份阳性结果,qSRCA方法和国标法的阳性检出率分别为3.33%和1.67%。经计算qSRCA方法检测志贺氏菌的敏感性为100%,特异性为98.31%,符合率为98.33%。结果表明,qSRCA方法适用于实际食品样品中志贺菌的定量检测。综上所述,本研究首次建立qSRCA定量检测食品中志贺氏菌的方法,该方法在等温条件下即可完成对志贺氏菌的定量检测,操作简便,具有高效短时、特异性和灵敏度高等特点,可实现志贺氏菌的快速检测。